Как формула инсулина в химии

Инсулин, получивший свое название от наименования панкреатических островков (лат. insula – островок), был первым белком, первичная структура которого была раскрыта в 1954 г. Ф. Сэнджером (см. главу 1). В чистом виде инсулин был получен в 1922 г. после его обнаружения в экстрактах панкреатических островков Ф. Бантингом и Ч. Бестом. Молекула инсулина, содержащая 51 аминокислотный остаток, состоит из двух полипептидных цепей, соединенных между собой в двух точках дисульфидными мостиками. Строение инсулина и его предшественника проинсулина приведено в главе 1 (см. рис. 1.14). В настоящее время принято обозначать цепью А инсулина 21-членный пептид и цепью В – пептид, содержащий 30 остатков аминокислот. Во многих лабораториях осуществлен, кроме того, химический синтез инсулина. Наиболее близким по своей структуре к инсулину человека является инсулин свиньи, у которого в цепи В вместо треонина в положении 30 содержится аланин.

Существенных различий в аминокислотной последовательности в инсулине от разных животных нет. Инсулины различаются аминокислотным составом цепи А в положениях 8–10.

Согласно современным представлениям, биосинтез инсулина осуществляется в β-клетках панкреатических островков из своего предшественника проинсулина, впервые выделенного Д. Стайнером в 1966 г. В настоящее время не только выяснена первичная структура проинсулина, но и осуществлен его химический синтез (см. рис. 1.14). Проинсулин представлен одной полипептидной цепью, содержащей 84 аминокислотных остатка; он лишен биологической, т.е. гормональной, активности. Местом синтеза проинсули-на считается фракция микросом β-клеток панкреатических островков; превращение неактивного проинсулина в активный инсулин (наиболее существенная часть синтеза) происходит при перемещении проинсулина от рибосом к секреторным гранулам путем частичного протеолиза (отщепление с С-конца полипептидной цепи пептида, содержащего 33 аминокислотных остатка и получившего наименование соединяющего пептида, или С-пепти-да). Длина и первичная структура С-пептида подвержена большим изменениям у разных видов животных, чем последовательность цепей А и В инсулина. Установлено, что исходным предшественником инсулина является препроинсулин, содержащий, помимо проинсулина, его так называемую лидерную, или сигнальную, последовательность на N-конце, состоящую из 23 остатков аминокислот; при образовании молекулы проинсулина этот сигнальный пептид отщепляется специальной пептидазой. Далее молекула проинсулина также подвергается частичному протеолизу, и под действием трипсиноподобной протеиназы отщепляются по две основные аминокислоты с N- и С-конца пептида С – соответственно дипептиды Aрг–Aрг и Лиз– –Aрг (см. рис. 1.14). Однако природа ферментов и тонкие механизмы этого важного биологического процесса – образование активной молекулы инсулина окончательно не выяснены.

Синтезированный из проинсулина инсулин может существовать в нескольких формах, различающихся по биологическим, иммунологическим и физико-химическим свойствам. Различают две формы инсулина: 1) свободную, вступающую во взаимодействие с антителами, полученными к кристаллическому инсулину, и стимулирующую усвоение глюкозы мышечной и жировой тканями; 2) связанную, не реагирующую с антителами и активную только в отношении жировой ткани. В настоящее время доказано существование связанной формы инсулина и установлена локализация ее в белковых фракциях сыворотки крови, в частности в области трансферринов и α-глобулинов. Молекулярная масса связанного инсулина от 60000 до 100000. Различают, кроме того, так называемую форму А инсулина, отличающуюся от двух предыдущих рядом физико-химических и биологических свойств, занимающую промежуточное положение и появляющуюся в ответ на быструю, срочную потребность организма в инсулине.

В физиологической регуляции синтеза инсулина доминирующую роль играет концентрация глюкозы в крови. Так, повышение содержания глюкозы в крови вызывает увеличение секреции инсулина в панкреатических островках, а снижение ее содержания, наоборот,– замедление секреции инсулина. Этот феномен контроля по типу обратной связи рассматривается как один из важнейших механизмов регуляции содержания глюкозы в крови. На секрецию инсулина оказывают влияние, кроме того, электролиты (особенно ионы кальция), аминокислоты, глюкагон и секретин. Приводятся доказательства роли циклазной системы в секреции инсулина. Предполагают, что глюкоза действует в качестве сигнала для активирования аденилат-циклазы, а образовавшийся в этой системе цАМФ – в качестве сигнала для секреции инсулина.

При недостаточной секреции (точнее, недостаточном синтезе) инсулина развивается специфическое заболевание – сахарный диабет (см. главу 10). Помимо клинически выявляемых симптомов (полиурия, полидипсия и полифагия), сахарный диабет характеризуется рядом специфических нарушений процессов обмена. Так, у больных развиваются гипергликемия (увеличение уровня глюкозы в крови) и гликозурия (выделение глюкозы с мочой, в которой в норме она отсутствует). К расстройствам обмена относят также усиленный распад гликогена в печени и мышцах, замедление биосинтеза белков и жиров, снижение скорости окисления глюкозы в тканях, развитие отрицательного азотистого баланса, увеличение содержания холестерина и других липидов в крови. При диабете усиливаются мобилизация жиров из депо, синтез углеводов из аминокислот (глюконеогенез) и избыточный синтез кетоновых тел (кетонурия). После введения больным инсулина все перечисленные нарушения, как правило, исчезают, однако действие гормона ограничено во времени, поэтому необходимо вводить его постоянно. Клинические симптомы и метаболические нарушения при сахарном диабете могут быть объяснены не только отсутствием синтеза инсулина. Получены доказательства, что при второй форме сахарного диабета, так называемой инсулинрезистентной, имеют место и молекулярные дефекты: в частности, нарушение структуры инсулина или нарушение ферментативного превращения проинсулина в инсулин. В основе развития этой формы диабета часто лежит потеря рецепторами клеток-мишеней способности соединяться с молекулой инсулина, синтез которого нарушен, или синтез мутантного рецептора (см. далее).

У экспериментальных животных введение инсулина вызывает гипогликемию (снижение уровня глюкозы в крови), увеличение запасов гликогена в мышцах, усиление анаболических процессов, повышение скорости утилизации глюкозы в тканях. Кроме того, инсулин оказывает опосредованное влияние на водный и минеральный обмен.

Механизм действия инсулина окончательно не расшифрован, несмотря на огромное количество фактических данных, свидетельствующих о существовании тесной и прямой зависимости между инсулином и процессами обмена веществ в организме. В соответствии с «унитарной» теорией все эффекты инсулина вызваны его влиянием на обмен глюкозы через фермент гексокиназу. Новые экспериментальные данные свидетельствуют, что усиление и стимуляция инсулином таких процессов, как транспорт ионов и аминокислот, трансляция и синтез белка, экспрессия генов и др., являются независимыми. Это послужило основанием для предположения о множественных механизмах действия инсулина.

Рис. 8.1. Инсулиновый рецептор (схема). Две α-цепи на наружной поверхности мембраны клетки и две трансмембранные β-цепи. Связывание инсулина с α-цепями запускает аутофосфорилирование остатков тирозина в β-цепях; активный тирозинкиназный домен затем участвует в фосфорилировании неактивных белков-мишеней в цитозоле.

Наиболее вероятной в настоящее время представляется мембранная локализация первичного действия почти всех белковых гормонов, включая инсулин. Получены доказательства существования специфического рецептора инсулина на внешней плазматической мембране почти всех клеток организма, а также образования инсулинрецепторного комплекса. Рецептор синтезируется в виде предшественника – полипептида (1382 аминокислотных остатка, мол. масса 190000), который далее расщепляется на α-и β-субъединицы, т.е. на гетеродимер (в формуле α₂–β₂), связанные дисульфидными связями. Оказалось, что если α-субъединицы (мол. масса 135000) почти целиком располагаются на внешней стороне биомембраны, выполняя функцию связывания инсулина клетки, то β-субъединицы (мол. масса 95000) представляют собой трансмембранный белок, выполняющий функцию преобразования сигнала (рис. 8.1). Концентрация рецепторов инсулина на поверхности достигает 20000 на клетку, и период их полужизни составляет 7–12 ч.

Самым интересным свойством рецептора инсулина, отличным от всех других рецепторов гормонов белковой и пептидной природы, является его способность аутофосфорилирования, т.е. когда рецептор наделен сам протеинкиназной (тирозинкиназной) активностью. При связывании инсулина с α-цепями рецептора происходит активирование тирозинкиназной активности β-цепей путем фосфорилирования их тирозиновых остатков. В свою очередь активная тирозинкиназа β-цепей запускает каскад фосфо-рилирования–дефосфорилирования протеинкиназ, в частности мембранных или цитозольных серин- или треонинкиназ, т.е. протеинкиназ и белков-мишеней, фосфорилирование в которых осуществляется за счет ОН-групп серина и треонина. Соответственно имеют место изменения клеточной активности, в частности активация и ингибирование ферментов, транспорт глюкозы, синтез полимерных молекул нуклеиновых кислот и белков и т.д . Следует подчеркнуть, однако, что тонкие молекулярные механизмы путей передачи сигнала от инсулинрецепторного комплекса на множество внутриклеточных процессов пока не раскрыты. Вполне возможно участие в подобных процессах ряда внутриклеточных вторичных мессенджеров, в частности циклических нуклеотидов, производных фосфатидилинозитолов и др. Нельзя исключить, кроме того, возможности существования внутриклеточного посредника или медиатора действия инсулина (особого внутриклеточного рецептора), контролирующего транскрипцию генов и соответственно синтез мРНК. Предполагают, что действием инсулина и участием в регуляции экспрессии генов или в транскрипции специфических мРНК может быть объяснена его роль в таких фундаментальных процессах жизнедеятельности, как эмбриогенез и дифференцировка клеток высших организмов.

источник

Инсули́н (от лат. insula — остров) — гормон пептидной природы, образуется в бета-клетках островков Лангерганса поджелудочной железы. Оказывает многогранное влияние на обмен практически во всех тканях. Основное действие инсулина заключается в снижении концентрации глюкозы в крови. Впервые был выделен канадскими учёными Ф. Бантингом и Ч. Бестом (1921—22).

Молекула инсулина образована двумя полипептидными цепями, содержащими 51 аминокислотный остаток: A-цепь состоит из 21 аминокислотного остатка, B-цепь образована 30 аминокислотными остатками. Полипептидные цепи соединяются двумя дисульфидными мостиками через остатки цистеина, третья дисульфидная связь расположена в A-цепи.

Первичная структура инсулина у разных биологических видов несколько различается, как различается и его важность в регуляции обмена углеводов. Наиболее близким к человеческому является инсулин свиньи, который различается с ним всего одним аминокислотным остатком: в 30 положении B-цепи свиного инсулина расположен аланин, а в инсулине человека — треонин; бычий инсулин отличается тремя аминокислотными остатками.

Биосинтез инсулина включает образование двух неактивных предшественников, препроинсулина и проинсулина, которые в результате последовательного протеолиза превращаются в активный гормон. Биосинтез препроинсулина начинается с образования сигнального пептида на полирибосомах, связанных с ЭР. Сигнальный пептид проникает в просвет ЭР и направляет поступление в просвет ЭР растущей полипептидной цепи. После окончания синтеза препроинсулина сигнальный пептид, включающий 24 аминокислотных остатка, отщепляется (рис. 11-24).

Проинсулин (86 аминокислотных остатков) поступает в аппарат Гольджи, где под действием специфических протеаз расщепляется в нескольких участках с образованием инсулина (51 аминокислотный остаток) и С-пептида, состоящего из 31 аминокислотного остатка.

Инсулин и С-пептид в эквимолярных количествах включаются в секреторные гранулы. В гранулах инсулин соединяется с цинком, образуя димеры и гексамеры. Зрелые гранулы сливаются с плазматической мембраной, и инсулин и С-пептид секретируются во внеклеточную жидкость в результате экзоцитоза. После секреции в кровь олигомеры инсулина распадаются. Т1/2 инсулина в плазме крови составляет 3-10 мин, С-пептида — около 30 мин.

Биологическая роль— Инсулин резко повышает проницаемость стенок мышечных и жировых клеток для глюкозы. Т. к. все процессы усвоения глюкозы происходят внутри клеток, а инсулин способствует транспорту глюкозы в них, то он обеспечивает утилизацию глюкозы организмом, синтез гликогена (резервного углевода) и накопление его в мышечных волокнах. Увеличивая поступление глюкозы в клетки жировой ткани, инсулин стимулирует образование жира в организме. Кроме того, инсулин стимулирует и синтез белка в клетке, увеличивая проницаемость клеточных стенок для аминокислот.

Гипергликемия — увеличение уровня сахара в крови.

В состоянии гипергликемии увеличивается поступление глюкозы как в печень, так и в периферические ткани. Как только уровень глюкозы зашкаливает, поджелудочная железа начинает вырабатывать инсулин.

Гипогликемия — патологическое состояние, характеризующееся снижением уровня глюкозы периферической крови ниже нормы ( Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]

источник

Инсулин является белком. Его структурная формула, предложенная Sanger, представлена ниже. В инсулине различают две полипептидные цепи: большую, состоящую из 30 аминокислотных остатков, содержащих два дисульфмдных мостика, и другую, более короткую, состоящую из 21 аминокислотного остатка, содержащую третий дисульфидный мостик.

Молекулярная структура инсулина, выделенного из поджелудочных желез животных разных видов, различна. Так, в инсулине свиней и китов последовательность аминокислотных остатков Тре-Сер-Илей замещает Ала-Сер-Вал между дисульфидным мостиком малой цепи в инсулине крупного рогатого скота или Ала-Гли-Вал в инсулине овец.

Инсулин человека отличается от инсулина свиней тем, что концевым аминокислотным остатком длинной цепи является не аланин, а треонин. В инсулине кроликов в этом положении находится остаток серина. Хотя указанные различия молекулярной структуры инсулина не отражаются на его биологической активности, они обусловливают видовую и иммунологическую специфичность гормона.

Инсулин почти нерастворим в воде при рН 5,3—5,4, соответствующем его изоэлектрической точке. Он имеет молекулярный вес 5734. Инсулин реагирует с двухвалентными катионами, особенно с ионами цинка, а также с такими основными белками, как протамины и гистоны. Молекулы инсулина реагируют друг с другом, образуя при этом более крупные агрегаты, молекулярный вес которых является кратным 5734.

Эти реакции, являющиеся обратимыми, сопровождаются изменением растворимости инсулина. Так, в присутствии ионов цинка инсулин теряет растворимость и осаждается из раствора в кристаллической форме. Цинк является обязательной составной частью молекулы инсулина; каждая молекула гормона содержит 3 атома этого металла.

Щелочи вызывают необратимую инактивацию инсулина, сопровождающуюся освобождением аммиака. Необратимая инактивация инсулина наступает и при реакциях, разрушающих дисульфидные связи в молекуле гормона. Подобно другим полипепгидам, инсулин расщепляется в желудочно-кишечном тракте на составляющие его аминокислоты.

Потеря аланина, стоящего у концевого углеродного атома длинной цепи, не влияет на биологическую активность гормона. Однако если одновременно отщепить и аспарагиновую кислоту, расположенную у концевого углеродного атома короткой цепочки, то остаток молекулы инсулина оказывается лишенным активности. Гормон утрачивает свою активность также при ацетилировании фенольных или карбоксильных групп и при йодировании тирозиновых остатков.

источник

В истории химии случались события, по своему драматизму напоминавшие штурм неприступной вершины, на которую пытаются взойти одновременно независимые группы альпинистов по различным маршрутам. Все это сопровождается обстановкой состязания – кто взойдет на вершину первым?

Далее речь пойдет о синтезе инсулина – событии, ставшем заметным достижением в химической науке. Точно так же, как перед штурмом вершины альпинисты создают базовые, промежуточные и штурмовые лагеря, синтез инсулина был хорошо подготовлен, но не теми, кто вышел на покорение вершины, а основательными работами исследователей-предшественников. Можно уверенно сказать, что создание исходного плацдарма впечатляет не меньше, чем последующий штурм. Инсулин по праву можно назвать популярнейшей молекулой ХХ столетия; с исследованиями этого соединения связаны имена семи (!) нобелевских лауреатов.

В середине XX в. инсулин был одним из наиболее интенсивно изучаемых веществ. Причина в том, что удалось объяснить происхождение одного из тяжелейших заболеваний – сахарного диабета. Болезнь возникает, когда в организме недостаточно гормона* инсулина. Инсулин запускает процессы, обеспечивающие поступление глюкозы (сахара) в клетки, а также стимулирует внутриклеточные механизмы, позволяющие усваивать глюкозу.

При недостатке инсулина глюкоза не расходуется клетками, она накапливается в крови и начинает через почки поступать в мочу. Повышенный уровень глюкозы в крови и ее выведение с мочой приводят к похуданию, чрезмерному мочеотделению, постоянному ощущению сильной жажды и голода. Организм старается компенсировать дефицит калорий, которые он теряет с мочой в виде глюкозы, и начинает использовать жировые запасы и тканевые белки (главным образом мышечные). Возникают утомление, сонливость, тошнота, нарушаются обменные процессы, что может привести к диабетической коме, а при отсутствии лечения к смерти.

Сахарный диабет встречается среди населения всех стран и у представителей всех рас. Самое раннее описание этого заболевания было сделано примерно 3000 лет назад в Древней Индии. Подробные симптомы болезни (обильное мочеотделение, чрезмерная жажда и потеря веса) были описаны в I в. н.э. Болезнь получила свое название от греческого diabetes, что означает «протекаю, прохожу сквозь» (имеется в виду чрезмерное мочеотделение).

Планомерное изучение этого заболевания длилось не одно столетие. В XVII в. английский врач Т.Уиллис обратил внимание на то, что моча у пациентов с такими симптомами имеет сладковатый вкус (провести подобный анализ мог только истинный ученый). Картина начала проясняться после опытов французского физиолога Клода Бернара (1813–1878), в которых он наблюдал собак с удаленной поджелудочной железой. Его опыты продолжили в 1889 г. немецкие физиологи Йозеф фон Меринг и Оскар Минковский. Они удаляли хирургическим путем поджелудочную железу у собак и затем наблюдали у них резкий подъем концентрации глюкозы в крови, ее появление в моче и другие признаки сахарного диабета. Таким образом они экспериментально доказали связь между поджелудочной железой и сахарным диабетом.

Некоторые физиологи высказывали предположение, что поджелудочная железа вырабатывает вещество, которое способствует усваиванию в организме глюкозы. В 1916 г. немецкий физиолог Шарпи-Шафер назвал это гипотетическое вещество инсулин (от латинского insula – островок, поскольку отчетливо наблюдаемые группы клеток поджелудочной железы к этому моменту именовали островками Лангерганса). Тогда это было только предположение, которое впоследствии полностью подтвердилось.

В 1921 г. трое канадских исследователей – профессор физиологии университета в г. Торонто (Канада) Джон Маклеод, врач-хирург Фредерик Бантинг и врач-физиолог Чарлз Бест сумели выделить инсулин из поджелудочной железы подопытных животных. Первые же опыты по введению полученного препарата собакам с удаленной поджелудочной железой продемонстрировали значительное снижение уровня сахара в крови животных и улучшение клинической картины.

11 января 1922 г. (знаменательный факт в истории мировой медицины) более чистый и активный препарат инсулина был введен первому пациенту – подростку, страдавшему тяжелой формой диабета. После полученного положительного эффекта были проведены аналогичные испытания еще на нескольких пациентах. Возникло новое направление в медицинской науке – гормонотерапия.

В 1923 г. Маклеод и Бантинг были удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине «за открытие инсулина». Бест не был включен в список лауреатов, и Бантинг отдал ему половину полученных денег (жест, достойный истинного ученого).

В 1926 г. было налажено серийное производство инсулина. Многие тысячи больных сахарным диабетом, ранее обреченных на смерть, были спасены и могли вести сравнительно нормальную жизнь, регулярно принимая лекарство.

Физиологи Маклеод и Бантинг использовали для лечения больных экстракт поджелудочной железы животных. Однако химиков всегда интересовало, как именно устроено то или иное соединение. Инсулин в кристаллическом виде впервые сумел получить в 1926 г. Дж.Абель. Именно благодаря его работам удалось наладить промышленное производство препарата. Абель также определил состав инсулина, стало понятно, что вещество представляет собой белковую молекулу. C этого момента исследования инсулина из медицины переходят в область химии, точнее, в руки биохимиков.

Все упомянутые выше работы подготовили решающий этап, позволивший выяснить, как устроена молекула, привлекавшая внимание столь большого числа исследователей. Решить эту задачу удалось американскому биохимику Фредерику Сенгеру. Вначале он разработал способ идентификации концевых аминогрупп в белковой молекуле путем обработки в щелочной среде динитрофторбензолом (впоследствии этот метод стал классическим). Далее он буквально разобрал на части всю молекулу инсулина и определил состав полученных аминокислот с помощью самых современных методов – электрофореза, разработанного А.Тизелиусом (Нобелевская премия, 1948 г.) и хроматографии, усовершенствованной А.Мартином и Р.Сингом (нобелевские лауреаты, 1952 г.). Однако установить, из каких аминокислот собрана белковая молекула, лишь половина дела, притом менее сложная. Главное – выяснить их последовательность в цепи.

Сенгер разработал план, по которому с помощью специально подобранных ферментов (биологических катализаторов) проводил расщепление белковой цепи на небольшие отрезки в заранее намеченных участках, а потом сопоставлял их состав. Работа представляла собой безупречное сочетание логики и экспериментального мастерства, и в 1958 г. ученому была присуждена Нобелевская премия «за работы по структуре протеинов, особенно инсулина». Свой метод Сенгер довел буквально до совершенства, со временем его методика стала общим принципом исследования структуры белков.

Попутно отметим, что Сенгер, применив похожие логические построения, но несколько изменив методику и используемые реагенты, сумел установить последовательность фрагментов в структуре знаменитой двойной спирали ДНК. За эти исследования в 1980 г. Сенгеру (совместно с У.Гилбертом и П.Бергом) была присуждена еще одна Нобелевская премия «за вклад в определение последовательности оснований в нуклеиновых кислотах». Таким образом, Сенгер – единственный дважды нобелевский лауреат по химии. Никто не мог предположить, что эти исследования ДНК со временем откроют новую страницу в химии инсулина, но об этом речь пойдет несколько позже.

Американский биохимик Винсент Дю Виньо, в течение нескольких лет изучавший инсулин, узнав о работах Сенгера, решил воспользоваться его методикой для расшифровки структуры двух других гормонов (вазопрессина и окситоцина). Однако он не только установил строение, но и синтезировал молекулы этих гормонов. Фактически он был первым, кто сумел синтезировать природные полипептиды. Эта работа ученого была отмечена Нобелевской премией в 1955 г., т.е. он получил премию на три года раньше Сенгера, чьи идеи помогли ему добиться столь великолепного результата. Работы Дю Виньо фактически открыли дорогу к синтезу инсулина.

Тем временем изучение инсулина продолжалось. Исследование лечебных свойств инсулина позволило установить, что его цинковый комплекс из нескольких молекул, так называемый Zn-инсулин, обладает более длительным лечебным действием. Строение этого комплекса оказалось весьма сложным (он содержит почти 800 атомов), поэтому были привлечены физико-химические методы анализа. В 1972 г. английский биофизик Дороти Кроуфут-Ходжкин (лауреат Нобелевской премии 1964 г. за определение с помощью рентгеновских лучей структур биологически активных веществ) установила трехмерную структуру этого необычайно сложного комплекса.

Упрощенный язык биохимиков

Прежде чем рассмотреть строение молекулы инсулина, познакомимся с тем, как биохимики изображают молекулы белков.

Все белки представляют собой полимеры, цепи которых собраны из фрагментов аминокислот. Аминокислоты – это органические соединения, содержащие в своем составе аминогруппу NH₂ и карбоксильную группу СООН. В образовании белков участвуют только такие аминокислоты, у которых между аминогруппой и карбоксильной группой всего один углеродный атом. В общем виде они могут быть представлены формулой H₂N–CH(R)–COOH. Группа R, присоединенная к атому углерода (тому, который находится между амино- и карбоксильной группой), определяет различие между аминокислотами, образующими белки. Эта группа может состоять только из атомов углерода и водорода, но чаще содержит помимо С и Н различные функциональные группы. Из всего многообразия существующих аминокислот (теоретически количество возможных аминокислот неограниченно) в образовании белков участвуют только двадцать, так называемые «фундаментальные» аминокислоты. Для «строительства» инсулина природа использовала 16 аминокислот (из допустимых двадцати) (табл.1).

Структура

Глицин

Аланин

Валин

Лейцин

Изолейцин

Серин

Цистеин

Лизин

Аргинин

Аспарагин

Глутаминовая кислота

Глутамин

Фениаланин

Тирозин

Гистидин

Пролин

Из превращений, показанных на схеме 1, следует, что при любом количестве соединяемых аминокислот на одном конце возникшей цепочки обязательно будет находиться аминогруппа, а на другом – карбоксильная. Фрагменты соединенных аминокислот обозначены (под фигурными скобками) теми сокращенными буквосочетаниями, которые указаны в табл. 1. Таким образом, вместо структурной формулы мы можем использовать сокращенное обозначение получившегося трипептида: ала-вал-гли. Поскольку количество аминокислот, используемых природой, всего двадцать, то подобные сокращения позволяют компактно записать формулу любого белка, и никакой неясности при этом не возникнет.

Молекула инсулина, как установил Сенгер, состоит из 51 аминокислотного остатка (это один из самых короткоцепочечных белков) и представляет собой две соединенные между собой параллельные цепи неодинаковой длины. На схеме 2 показана последовательность аминокислот в молекуле инсулина: А-цепь содержит 21 аминокислотный остаток, Б-цепь – 30.

Содержащиеся в молекуле остатки аминокислоты цистеина (сокращенное обозначение Цис) образуют дисульфидные мостики S-S-, которые связывают две полимерные цепи молекулы и, кроме того, образуют перемычку внутри А-цепи. При таком компактном изображении белковой молекулы символы химических элементов используют только для обозначения дисульфидных мостиков и концевых групп (NH₂ и COOH).

Для сравнения далее показана структурная формула инсулина в виде объемной шаростержневой модели (схема 3).

Согласитесь с тем, что биохимики выбрали компактный и необычайно удобный для написания способ изображения белковых молекул.

Казалось бы, после того как установлена структура молекулы, синтезировать ее заново не составит большого труда.

Основная трудность при сборке белковой молекулы – добиться, чтобы необходимые аминокислоты соединялись в строго определенном порядке. При этом нужно учитывать, что аминокислота способна реагировать не только с другой аминокислотой, но и сама с собой, и в итоге может получиться молекула, не имеющая ничего общего с тем, что синтезирует живой организм.

К моменту, когда решался вопрос о синтезе инсулина, было разработано несколько соответствующих методик. Для того чтобы аминокислота, которую намечено было присоединить к растущей цепи, не реагировала сама с собой, ее реакционноспособные концы (аминогруппу NH₂ и карбоксильную группу СООН) блокировали специальным образом: карбоксильную группу переводили в п-нитрофениловый эфир, а со стороны аминогруппы присоединяли карбоксибензильную группу. Такая блокированная молекула реагировала с аминогруппой, находящейся на конце растущей цепи, по схеме 4 (cм. c. 8).

В результате растущая цепь удлинялась на одно пептидное звено. Однако теперь на конце цепи разместилась блокирующая карбоксибензильная группа. Чтобы сделать «аминный хвост» реакционноспособным, т. е. перевести его в активную форму, осуществляли обработку бромоводородом с уксусной кислотой по схеме 5 (cм. c. 8).

В результате аминогруппа на конце цепи (она показана в виде аммониевой соли с HBr) вновь была готова реагировать с очередной аминокислотой (естественно, тоже содержащей блокирующие группы). Параллельно были разработаны и другие методы сборки полипептидных цепей.

К полному синтезу инсулина в 1962 г. приступили практически одновременно три группы исследователей: группа П.Катсоянниса в г. Питсбурге (США), группа Г.Цана в г. Аахене (Германия), а также группа китайских химиков (Шанхай и Пекин). Все три группы действовали по весьма похожим стратегиям: собрали отдельно короткую и длинную цепи из заготовленных фрагментов, а затем соединяли обе цепи дисульфидными мостиками.

Короткую А-цепь все три группы исследователей собирали из двух одинаковых блоков.

1-й блок: гли-иле-вал-глу-глн-цис-цис-тир-сер;

2-й блок: иле-цис-сер-лей-тир-глн-лей-глу-асн-тир-цис-асн.

Длинную Б-цепь собирали из четырех полипептидных блоков, однако длина этих блоков у разных групп ученых несколько различалась (табл. 2).

1-й блок	3-й блок	Аахенская	Сер-гис-лей- вал-глу-ала	Глу-арг-глу-фен-фен- тир-тир-про-лиз-тир
Фен-вал-асн-глн- гис-лей-цис-гли-сер	Ала-лей-тир-лей- вал-цис-глу	Пекинско- шанхайская	Сер-гис-лей-вал- глу-ала-лей-тир	Глу-арг-глу-фен-фен- тир-тир-про-лиз-тир

Различия возникли из-за того, что методы соединения блоков и способы промежуточной защиты, используемые каждой из исследовательских групп, были неодинаковы. Естественно, на последнем этапе у всех групп получились одинаковые цепи. Приблизительно год ушел на создание исходных блоков. Подстегиваемая обстановкой соревнования аахенская группа интенсифицировала работу и в декабре 1963 г. сообщила об успешном синтезе инсулина. Эта группа буквально вырвала первенство у питсбургских химиков, которые сообщили об успешном результате в марте 1964 г. Окончательный выход чистого продукта колебался в пределах 0,02–0,07%. У китайских химиков выход был несколько выше (1,2–2,5%); разумеется, о производстве инсулина по таким методикам не могло быть и речи.

Синтез инсулина стал убедительной победой классической синтетической химии пептидов. Несмотря на низкий выход продукта, все признавали, что была проделана выдающаяся работа, которая позволила изменить образ мышления химиков, сформулировать новые принципы сборки больших молекул, отработать стратегию синтеза и подобрать оптимальные методики. Все это заметно повысило общий уровень органической химии. Тем не менее истинного триумфа не получилось, потому что почти одновременно с успешным завершением этих работ появилась принципиально иная, более совершенная методика сборки белковых молекул.

Профессор Рокфеллеровского университета (Нью-Йорк) Роберт Меррифилд, занимаясь химией белков, высказал оригинальную идею: первую аминокислоту можно закрепить одним концом на некой нерастворимой поверхности (носителе). Затем следует присоединить к другому ее концу следующую аминокислоту, при этом нежелательные побочные продукты и промежуточные реагенты, не вступившие в реакцию, можно будет вымывать из реакционного сосуда после каждой стадии, а растущий полипептид, прикрепленный к носителю, останется при этом незатронутым. Молекулы растущих полипептидов будут подвешены «за хвост» к твердой поверхности носителя, а когда процесс синтеза завершится, конечный полипептид можно отделить от носителя.

Меррифилду удалось реализовать эту идею. Первую аминокислоту присоединяют к нерастворимому полимерному гелю (сшитый полистирол) с введенными в него хлорметильными группами CH₂Cl, которые способны реагировать с СООН-группами аминокислоты. Чтобы взятая для реакции аминокислота не прореагировала сама с собой и не присоединилась аминогруппой к подложке, NH₂-группу этой кислоты предварительно блокируют объемистым заместителем – [(С₄Н₉)₃]₃ОС(О)-группой. После того как аминокислота присоединилась к полимерной подложке, блокирующую группу удаляют и в реакционную смесь вводят другую аминокислоту, у которой также предварительно заблокирована NH₂-группа. В такой системе возможно только взаимодействие NH₂-группы первой аминокислоты и COOH-группы второй аминокислоты, которое проводят в присутствии катализаторов (солей фосфония). Далее схему присоединения повторяют, вводя третью аминокислоту. Вся схема синтеза полипептидных цепей, позволяющая чередовать аминокислотные остатки в заданном порядке, выглядит следующим образом (схема 6).

На последней стадии полученные полипептидные цепи отделяют от полистирольной подложки действием HBr в присутствии трифторуксусной кислоты F₃CCOOH.

Меррифилд не только экспериментально проверил эффективность предложенного метода, но и сконструировал аппарат, который практически автоматизировал пептидный синтез. Это устройство представляло собой контейнер для аминокислот и реагентов – реакционный сосуд с автоматическими впускным и выпускным клапанами и программным механизмом, который регулировал последовательность процессов и длительность каждой стадии.

С помощью сконструированного аппарата Меррифилд и его коллеги синтезировали инсулин всего за 20 дней (притом с выходом в десятки процентов), в то время как «первопроходцы» – аахенская, питсбургская и шанхайская группы – затратили на это больше года.

В 1985 г. Меррифилд был удостоен Нобелевской премии «за развитие методологии твердофазного химического синтеза».

Во время проведения описанных выше работ химиков не оставляла мысль, что те задачи, которые ученые решают с таким трудом, Природа решает легко и исключительно аккуратно. Синтез белков в живых организмах проходит в мягких условиях, быстро и без образования побочных продуктов. До определенного момента химики могли лишь с удивлением и интересом наблюдать подобные «синтезы», однако стремительное развитие биохимии позволило активно вмешаться в эти процессы, в том числе открыть принципиально новый способ синтеза инсулина.

Ранее было сказано, что Ф.Сенгер (установивший структуру инсулина) сумел определить последовательность фрагментов в структуре ДНК, за что был удостоен второй Нобелевской премии. Эта работа позволила биохимикам перейти к следующему этапу – встраивать в генетический код ДНК заранее намеченные фрагменты. Основная идея состояла в том, чтобы в ДНК некоторых бактерий включать гены высших организмов. В результате бактерии приобретают способность синтезировать соединения, которые прежде могли синтезировать только высшие организмы. Такая технология получила название «генная инженерия».

В 1981 г. канадский биохимик Майкл Смит был приглашен в научные соучредители новой биотехнологической компании «Зимос». Один из первых контрактов фирмы был заключен с датской фармацевтической компанией «Ново» по разработке технологии производства человеческого инсулина в дрожжевой культуре. В результате совместных усилий инсулин, полученный по новой технологии, в 1982 г. поступил в продажу. В 1993 г. за цикл работ в этой области М.Смит (совместно с К.Муллисом) получил Нобелевскую премию. В настоящее время инсулин, получаемый методом генной инженерии, практически вытеснил инсулин животных.

Итак, мы познакомились с четырьмя способами получения инсулина: экстракцией из поджелудочной железы животных (группа Д.Маклеода), многоступенчатым синтезом (группа Г.Цана), автоматизированной сборкой (Р.Меррифилд), методом генной инженерии (М.Смит). Оставим в стороне медицинский аспект проблемы, сосредоточим внимание на химии. Могло сложиться впечатление, что работы Смита сделали ненужными все предшествующие исследования. На самом деле это не так, все методы неразрывно связаны, ни один из этапов упомянутых исследований нельзя «выбросить». Инсулин, выделенный из поджелудочной железы животных, позволил Сенгеру определить его структуру, а без этого последующий синтез был невозможен. Группа Цана разработала химические приемы сборки цепей и способы промежуточной блокировки функциональных групп, которыми воспользовался Меррифилд при создании автоматической установки синтеза. Работы Смита, по существу, опирались на весь предшествующий опыт, накопленный при изучении инсулина. При синтезе некоторых короткоцепочечных гормонов автоматическая установка Меррифилда технически оказалась предпочтительнее «генной инженерии».

Обобщая, можно сказать, что все этапы, которые мы рассмотрели, – это естественный, традиционный и, если не бояться торжественных слов, величественный путь науки.

* Гормоны (от греческого – привожу в действие, побуждаю) – специфические физиологически активные вещества, вырабатываемые специальными эндокринными органами или тканями, секретируемые в кровь или лимфу и действующие на строение и функции организма.

источник

Рис. 8.1.Инсулиновый рецептор (схема). Две α-цепи на наружной поверхности мембраны клетки и две трансмембранные β-цепи. Связывание инсулина с α-цепями запускает аутофосфорилирование остатков тирозина в β-цепях; активный тирозинкиназный домен затем участвует в фосфорилировании неактивных белков-мишеней в цитозоле.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

источник