Хирургическая модель
Впервые экспериментально сахарный диабет путем удаления поджелудочной железы удалось получить и официально обосновать физиологам Оскару Минковскому и Жозефу ван Мерингу. В научных достижениях наряду с упорным трудом играет немаловажную роль такое качество как интуиция – удивительная способность искать одну вещь и в процессе находить другую. Блестящий научный эксперимент Минковского как нельзя лучше иллюстрирует это утверждение. Ученый так описывал эту ситуацию: он и его коллега в университете Страсбурга Жозеф ван Меринг обсуждали следующий вопрос – являются ли свободные жирные кислоты необходимыми для всасывания жиров, вопрос, которым в то время занимался ван Меринг. Поджелудочная железа, по его мнению, играла главную роль в этом процессе, и ван Меринг попытался решить вопрос путем перевязывания панкреатических протоков, тем не менее без всякого успеха. Минковский предложил провести тотальную панкреатэктомию для доказательства теории ван Меринга, операцию, выполнение которой последний считал невозможным. Тем не менее, Минковский, имея уже опыт удаления печени у птиц, попросил ван Меринга подготовить собаку для эксперимента, что было выполнено в тот же день, и ван Меринг ассистировал Минковскому в проведении операции. Панкреатэктомия, без какой-либо специальной подготовки, была выполнена успешно, и проопериванную собаку было решено использовать для изучения ван Мерингом жирового обмена, однако впоследствии коллега Минковского вынужден был несколько дней отсутствовать в лаборатории. Естественно, ни у кого из них не было и мысли о развитии диабета после панкреатэктомии. Во время отсутствия ван Меринга, произошло нечто, что коренным образом изменило ход медицинской науки. Как сам Минковский впоследствии сообщал о полученных результатах: после экстирпации поджелудочной железы у собаки появился сахарный диабет. Он развился через пару дней после операции и длился несколько недель, пока не наступила гибель животного. Отмечалась глюкозурия в сочетании с полиурией, выраженный голод, потеря веса и астения несмотря на достаточное обеспечение питательными веществами. Моча экспериментальных животных также содер жала некоторое количество ацетона. Уровень сахара крови был значительно повышен, у одной собаки он достиг уровня 0,3%, у другой – 0,46%. Запас гликогена в органах практически исчезал. Солнечное сплетение в процессе операции не было повреждено, следовательно, развитие диабета было связано непосредственно с удалением поджелудочной железы. Переливание крови собак с диабетом здоровой особи не приводило к глюкозурии у последней. Интересно, что Минковский совершил свое открытие более чем за десять лет до того, как благодаря работам ученого Старлинга был введен термин «гормон» и появилось такое понятие, как «физиология эндокринной системы». В ходе эксперимента Минковским, а затем и другими учеными был доказан очевидный факт – отсутствие поджелудочной железы является необходимой предпосылкой для развития сахарного диабета. Однако механизм этого явления долгое время оставался неясным.
Химическая модель
а) аллоксановый диабет
Наибольшее распространение в современной экспериментальной диабетологии получили химические модели сахарного диабета.
Аллоксан является продуктом распада мочевой кислоты и представляет собой белое кристаллическое вещество, розовеющее на воздухе. Средство обладает диабетогенным действием только при парентеральном способе введения – внутривенном, подкожном, внутримышечном и интраперитонеальном. Оно используется для изучения сахарного диабета типа 1. Эффективная доза зависит от вида животного, способа введения и состояния питания. Для мышей и крыс чаще употребляется внутрибрюшинное введение моногидрата аллоксана однократно в виде 0,9 % нормального солевого раствора в дозе 150 мг/кг или внутривенное введение в виде 5 % водного раствора в дозе 65 мг/кг. Экспериментальная доза должна быть тщательно подобрана, чтобы избежать чрезмерного повреждения панкреатической ткани. У исследованных животных после введения ал локсана в диабетогенных дозах выявляется развитие трехфазной или четырехфазной гликемической кривой. Согласно авторам, первая скоротечная гипогликемическая фаза длительноcтью максимально 30 мин. начинается с первых минут после введения аллоксана. Этот короткий гипогликемический ответ – результат быстрой стимуляции секреции инсулина, который подтверждается увеличением его концентрации в плазме крови. Механизм этой гиперинсулинемии временное увеличение АТФ, обусловленное торможением фосфорилирования глюкозы вследствие угнетения глюкокиназы. Вторая фаза гликемической кривой начинается с подъема концентрации глюкозы через один час после введения аллоксана. Это первая гипергликемическая фаза после контакта В-клеток с токсином. Гипергликемия обычно остается на протяжении 2-4 часов и обусловлена уменьшением концентрации инсулина плазмы в связи с угнетением его секреции панкреатическими В-клетками. Однако есть и другие мнения. Ряд авторов считает гипергликемию следствием стресc-реакции со стороны надпочечников, отвечающих повышенным выделением адреналина или же влиянием глюкагона и гормонов гипоталамуса. Спустя 4-8 часов (по некоторым авторам 6-12 часов) после введения аллоксана наступает третья фаза гликемической кривой, характеризующаяся глубокой гипогликемией, продолжающейся до суток. Иногда без инъекции глюкозы она может закончиться судорогами и смертью животных. Высокая летальность подопытных животных – основной недостаток экспериментального моделирования сахарного диабета путем введения аллоксана. Согласно подавляющему большинству работ, гипогликемия обусловлена освобождением в кровь инсулина из разрушающихся В-клеток. Как подтверждает морфометрический и ультраструктурный анализ, изменения охватывают не только секреторные гранулы с потерей их содержимого, но и плазмолемму, компоненты ядра и многие субклеточные органеллы (гладкую эндоплазматическую сеть, комплекс Гольджи, митохондрии), нередко они заканчиваются некрозом В-клеток. Если животные в предыдущей стадии не погибают, то возникает вторичная устойчивая гипергликемия, которая свидетельствует о развитии диабета. Она рассматривается как четвертая, финальная фаза гликемической кривой, характеризующей аллоксановый диабет. Морфологические и ультрамикроскопические данные свидетельствуют о полной дегрануляции и потере целостности В-клеток. Другие эндокринные клетки, как и клетки экзокринной паренхимы, остаются интактными, подтверждая избирательный характер поражения В-клеток этим токсином. Патогенез экспериментального аллоксанового диабета можно представить как последовательность взаимодействия значительного количества факторов, совокупное действие которых приводит к деструкции, уменьшению количества В-клеток и диабетогенному эффекту.
б) стрептозотоциновый диабет
Среди химических моделей экспериментального диабета стрептозотоциновая наряду с аллоксановой является наиболее распространенной. Стрептозотоцин (стрептозоцин, изостоцин, занозар) — синтетический препарат, полученный из микроорганизмов Streptomyces achromogenes, откуда и произошло его название. Стрептозотоцин является токсическим соединением из группы производных нитрозомочевины, избирательно проникающим в панкреатические бета-клетки посредством переносчика GLUT-2. Его панкреатотоксичность в значительной мере связывают с алкилирующей активностью его метильной группы, которая способна вызывать дефицит запасов кофактора NAD+, а затем и энергетических субстратов в виде АТФ, что неминуемо приводит, в конечном счёте, к некрозу бета-клеток. Данный процесс усугубляется
активацией свободнорадикального окисления, связанного с генерацией пероксинитрита из избыточно образующегося оксида азота, донатором которого является нитрозогруппа стрептозотоцина. Диабетогенный эффект наблюдается у многих видов животных, включая мышей, собак, кошек, обезьян, морских свинок и др. Наиболее резистентными оказались кролики и свиньи, а максимальная сенсибилизация выявлена у крыс, при этом оптимальная диабетогенная доза для крысы уменьшается по мере увеличение массы животного. Замечено, что при использовании высоких цитотоксических доз стрептозотоцина первоначальные функциональные изменения постепенно переходят в серьезные нарушения. Они носят более общий и неспецифический характер и, прогрессируя, приводят к гибели клеток. В случае применения более низких доз стрептозотоцина многие В-клетки способны выдержать первоначальное воздействие, но длительное время обнаруживают снижение функции в результате недостаточного окислительного метаболизма митохондрий. Также отмечено, что особи мужского пола при сопоставимой дозе развивают более выраженную гипергликемию. Для получения экспериментального диабета существует несколько способов введения препарата в организм: внутривенный, внутрибрюшинный и метод прямой инфузии в сосуды поджелудочной железы. В связи с неустойчивостью стрептозотоцина и коротким периодом его полураспада самым надежным считается внутривенное введение.
Каковы же изменения концентрации глюкозы крови в ответ на введение препарата? Они носят трехфазный характер. В отличие от воздействия аллоксаном не развивается начальная скоротечная гипогликемическая фаза, обусловленная торможением фосфорилирования глюкозы в результате угнетения глюкокиназы. Установлено, что стрептозотоцин не угнетает глюкокиназу. Первая гипергликемическая фаза начинается через 1 час после введения стрептозотоцина, достигая пика подъема глюкозы через 2 часа и продолжается до 4-х часов. О причинах развития ранней гипергликемии имеются разные мнения. Большинство авторов считают её результатом угнетения секреции инсулина, вызванной токсическим воздействием стрептозотоцина на В-клетки поджелудочной железы, что приводит к нарушению синтеза проинсулина и инсулина. Некоторые авторы связывают её с повышением скорости печеночного гликогенолиза или рассматривают как вторичную по отношению к повышению содержания свободных жирных кислот. Следующая, гипогликемическая, фаза наступает спустя 4-8 часов после введения стрептозотоцина и продолжается в течение нескольких часов (до суток). По единодушному мнению авторов, она считается следствием освобождения инсулина из поврежденных В-клеток. Третья фаза гликемической кривой является финальной и характеризуется устойчивой гипергликемией и развитием перманентного стрептозотоцинового диабета, наблюдающегося через 24 часа после введения препарата. Морфологический и ультрамикроскопический анализ свидетельствует о полной дегрануляции и потере целостности В-клеток.
в) дитизоновый диабет
Является наиболее известным среди моделей, так называемого, «цинкового» диабета. Чтобы понять механизм его моделирования, нужно знать биологическую роль цинка относительно рассматриваемой нами темы. Итак, цинк является составной частью каталитически активного центра целого ряда ферментов – дегидрогеназы, карбоксипептидазы, трансфорилазы. Определенное количество ионов цинка содержится в панкреатических островках человека, кроликов, собак, мышей, крыс, котов и других животных, исключая морских свинок. С помощью гистохимических методов было показано, что цинк находится в тесной функциональной связи с инсулином непосредственно в секреторных гранулах, образуя специфические нерастворимые комплексы депонированного гормона. Под влиянием стимуляторов секреции инсулина происходит изменение характера связи и нерастворимый комплекс цинк-инсулин становится растворимым. При введении глюкозы количество цинка в В-клетках уменьшается, почти полностью исчезая при длительной нагрузке глюкозой. Установлено, что любые вещества, вступающие в соединения с цинком и нарушающие его связь с инсулином, могут обладать диабетогенным действием. Таким образом, дитизон блокирует в островках поджелудочной железы цинк, в результате чего происходит разрушение В-клеток.
Теперь перейдем непосредственно к механизму моделирования дитизонового диабета. Дитизон, химически представляющий собой дифенилтиокарбазон, рекомендуется вводить в водном растворе аммиака. Наилучшим объектом для изучения дитизонового диабета являются кролики, хотя удалось вызвать его и у мышей. Предварительное голодание животных в течение 1-2 суток значительно повышает их чувствительность к дитизону, как и к остальным диабетогенным веществам. Через 2-5 мин. после введения дитизон соединяется с цинком в панкреатических В-клетках, образуя дитизонат цинка. В первые сутки после введения диабетогенной дозы дитизона происходит трехфазное колебание концентрации сахара в крови, аналогичное описанному при аллоксановом диабете. Оно сопровождается структурными изменениями В-клеток. Первые изменения в виде небольших очагов опустошения цитоплазмы В-клеток начинают развиваться уже через 15 минут после образования комплекса цинк – дитизон. Через 30 мин. после введения дитизона наблюдается первая фаза — гипергликемия, достигающая максимума через 1-3 часа, обусловленная мобилизацией гликогена из печени. Вторая, гипогликемическая, фаза обусловлена выходом в кровь инсулина из разрушающихся В-клеток. Максимум гипогликемии наступает через 8-18 часов после введения дитизона. В случае тяжелой гипогликемии животные иногда погибают при явлениях жестоких судорог. Глубина гипогликемии позволяет судить о тяжести развивающегося в дальнейшем дитизонового диабета. Через 24-28 часов появляется вторичная гипогликемия и развивается диабет, характеризующийся стойкой гипергликемией, гликозурией, полиурией, полидипсией и полифагией.
Различают 3 типа течения дитизонового диабета. Первый тип характеризуется острым развитием заболевания. Кролики погибали через 5-7 дней после введения дитизона при явлениях, напоминавших диабетическую кому. Второй тип характеризуется хроническим течением заболевания, что наблюдалось у большинства животных. Они могли жить без введения инсулина свыше 400 дней. Третий тип заболевания характеризовался спонтанным выздоровлением от дитизонового диабета. Уровень глюкозы в крови приходил к норме, исчезал сахар из мочи, нарастал вес животных. При гистологическом исследовании поджелудочной железы можно было подтвердить восстановление инкреторной функции островковой ткани. У выздоровевших животных обнаруживали пылевидную зернистость, заполнявшую апикальную или назальную часть клеток или располагавшуюся в виде пристеночной каемочки. Зернистость была выражена значительно слабее, чем у интактных животных, но, по-видимому, образовывалась в количестве, достаточном для удовлетворения потребности организма в инсулине. Новообразование В-клеток обнаруживалось в эпителии протоков и в экзокринной ткани. Обнаруживали митотические деления В-клеток, свидетельствующие о репаративных процессах в островковой ткани.
Итак, мы рассмотрели хирургическую модель и основные химические модели экспериментального сахарного диабета и можем сделать вывод, что среди представленных моделей предпочтение отдается стрептозотоциновому диабету. Преимущество его заключается в относительной простоте воспроизведения, чего нельзя сказать о панкреатэктомии, высокой избирательности воздействия, возможности получения диабета различной степени тяжести и длительности, что позволяет смоделировать как постепенно развивающуюся дисфункцию В-клеток, так и нарушение толерантности к глюкозе и развитие связанных с ней расстройств. «Цинковые» формы диабета являются удобной моделью вследствие простоты их получения, незначительных побочных явлений на другие органы и ткани. Однако недостатком данной модели является ограниченный выбор животных. Что же касается аллоксанового диабета, то главным недостатком этой модели, как упоминалось нами выше, является высокая летальность подопытных животных.
Эндокринная модель
Эндокринные модели сахарного диабета основаны на действии контринсулярных гормонов. Моделирование этим путем осложняется тем, что, кроме гипофиза и надпочечников, многие железы внутренней секреции (щитовидная, поджелудочная железа) также влияют на углеводный обмен и могут содействовать развитию сахарного диабета.
а) стероидный диабет
Моделирование стероидного диабета на подопытных животных актуально, т.к. позволяет изучить течение этого заболевания у людей. Эндогенный стероидный диабет у людей возникает при заболеваниях, обусловленных избыточной активностью АКТГ, вторичным гиперкортицизмом или первичным гиперкортицизмом, связанным с кортикостеромой. Экзогенный стероидный диабет возникает при длительном лечении препаратами глюкокортикоидов больных, например, ревматоидным артритом, бронхиальной астмой, коллагенозами.
С целью изучения заболевания у людей проводится экспериментальное моделирование на животных путём введения им кортизона. У кроликов, получавших кортизон, наблюдалось развитие стероидного диабета, так как усиливается глюконеогенез, тормозится окисление глюкозы и образование из нее жира. Для данного диабета характерна начальная гиперинсулинемия, что обсуловлено дегрануляцией В-клеток и повышением их митотической активности, затем зафиксировано снижение чувствительности к инсулину (инсулинорезистентность) и последующее поражение инсулярного аппарата с возникновением классического синдрома инсулинодефицитного диабета.
б) гипофизарный диабет
Способность вызывать гипергликемию и глюкозурию приписывают также и соматотропному гормону передней доли гипофиза. Длительное введение соматотропного гормона в организм усиливает образование в печени глюкозы из аминокислот и жиров, а также угнетает потребление глюкозы тканями. Гипергликемическое действие соматотропного гормона оказывает сначала стимулирующее влияние на инсулярные клетки поджелудочной железы, которое в конце концов приводит к истощению B-клеток.
Введение собакам парентерально экстракта из передней доли гипофиза в течение 2 — 3 недель вызывает заметную гипергликемию с глюкозурией и кетонемию. При этом в островковом аппарате обнаруживаются дегенеративные изменения. Участие гипофиза в расстройствах углеводного обмена видно также из того, что удаление железы вызывает гипогликемию, особенно у голодающего животного. Если же сначала вызвать панкреатическую глюкозурию, а затем удалить гипофиз, то проявление глюкозурии значительно ослабевает.
Иммунная модель
Как нам известно, одной из причин сахарного диабета I типа является аутоиммунное нарушение. При этом организм вырабатывает антитела против собственного инсулина, а также против клеток островков Лангерханса. В результате возникает аутоиммунное повреждение В-клеток поджелудочной железы, приводящее к абсолютной недостаточности инсулина в организме.
На основе этих процессов экспериментально моделируют сахарный диабет I типа у подопытных животных путем введения описанных выше антител. Недостаток данного метода заключается прежде всего в сложности получения необходимых антител по сравнению с теми же химическими моделями, где получить вещества гораздо проще.
Механическое удерживание земляных масс: Механическое удерживание земляных масс на склоне обеспечивают контрфорсными сооружениями различных конструкций.
Несмотря на достигнутые успехи в лечении пациентов с сахарным диабетом (СД), диабетическая нефропатия по-прежнему остаётся одной из основных причин заболеваемости и смертности пациентов с сахарным диабетом [1], как и десятилетие назад [5], принося национальной системе здравоохранения значительные социально-экономические потери [4]. Являясь самостоятельной лидирующей причиной терминальной стадии хронической болезни почек в большинстве стран мира, диабетическая нефропатия (ДН), трактуемая с 2007 г. как диабетическая болезнь почек [3], с течением времени развивается по меньшей мере у трети пациентов с СД [13] и в своём классическом течении проходит прогрессию от стадии нормоальбуминурии через микроальбуминурию до макроальбуминурии / протеинурии и снижения скорости клубочковой фильтрации (СКФ) [34]. Важным с точки зрения понимания патофизиологических механизмов возникновения и прогрессирования ДН и разработки профилактических и лечебных подходов является использование адекватных моделей ДН у экспериментальных животных, максимально точно воспроизводящих стадии естественного течения этого микрососудистого осложнения СД у людей.
Типы моделей сахарного диабета у экспериментальных животных
Поскольку для возникновения ДН необходимо наличие гипергликемии (о чём свидетельствует отсутствие подобных почечных изменений у пациентов без СД), в основе воспроизведения ДН как при СД 1 типа, так и при СД 2 типа у экспериментальных животных лежит индукция гипергликемического состояния.
Существует множество моделей спонтанного развития у грызунов СД 1 типа (биобридинговые, LETL, WBN/Kob крысы, NOD-мыши и др.) и 2 типа (крысы и мыши с дефектом синтеза лептина или лептинового рецептора и др.), полученные в результате передаваемых по наследству генетических мутаций или отобранные из аутбредных животных без диабета (например, крысы Goto-Kakizaki, мыши Tsumara Suzuki и др.) [7, 10]. СД может быть вызван хирургическим путём (посредством частичной или тотальной панкреатэктомии, классическим примером которой является эксперимент О. Минковского и Й. Меринга на собаках [8], фармакологическими препаратами (вызывающими деструкцию секретирующих инсулин бета-клеток поджелудочной железы [30]), посредством использования методов генной инженерии (технологии «нокаута» и трансгенной гиперэкспрессии специфических генов [7]), назначением специальных диетических рационов [6, 35], а также различными вариантами их сочетания.
Тем не менее, несмотря на довольно обширный выбор моделей СД у животных, во многих экспериментальных лабораториях для моделирования осложнений заболевания, в т.ч. ДН, используется введение диабетогенного цитотоксина стрептозотоцина (СТЗ) [43].
Механизм диабетогенного действия стрептозотоцина
Стрептозотоцин является токсическим соединением из группы производных нитрозомочевины, связанным в С2 положении с D-глюкозой [29], избирательно проникающим в панкреатические бета-клетки посредством переносчика GLUT-2 [28]. Панкреатотоксичность СТЗ в значительной мере связывают с алкилирующей активностью его метильной группы, приводящей к фрагментации ДНК бета-клеток, в ответ на которую активируется участвующий в репарации повреждённой ДНК фермент поли (АДФ-рибоза) полимераза (PARP). Развивающийся в связи с этим дефицит запасов кофактора NAD+, а затем и энергетических субстратов в виде АТФ, неминуемо приводит, в конечном счёте, к некрозу бета-клеток [44]. Данный процесс усугубляется активацией свободнорадикального окисления, связанного с генерацией пероксинитрита из избыточно образующегося оксида азота, донатором которого является нитрозогруппа СТЗ [39].
Диабетогенный эффект СТЗ наблюдается у многих видов животных, включая мышей, собак, кошек, обезьян, морских свинок и др. Наиболее резистентными к действию СТЗ оказались кролики и свиньи, а максимальная сенсибилизация выявлена у крыс, при этом оптимальная диабетогенная доза СТЗ для крысы уменьшается по мере увеличение массы животного. [18, 22, 33] Также отмечено, что особи мужского пола при сопоставимой дозе развивают более выраженную гипергликемию [32].
Технология приготовления цитратного буфера и раствора стрептозотоцина
Порошок стрептозотоцина, который до использования должен храниться в защищённом от света пластиковом флаконе с осушителем при температуре -20° С, растворяют в натриевом цитратном буфере с pH 4,5. Для приготовления раствора цитратного буфера с требуемым pH 4,5 необходимо: 1) смешать 47 мл 0,1 М раствора лимонной кислоты (содержит 21,01 г/л моногидрата лимонной кислоты) и 53 мл 0,1 М раствора тринатриевой соли лимонной кислоты (содержит 29,41 г/л дигидрата тринатриевой соли); 2) довести содержимое раствора до 950-970 мл дистиллированной водой, перемешать мешалкой; 3) аккуратно довести объём раствора до 1000 мл, параллельно измеряя рН-метром pH получившегося раствора. 4) Если рН раствора выше 4,5, добавить несколько капель 0,1 М раствора лимонной кислоты (2,1 гр цитрата довести до объёма 10 мл), или добавить несколько капель водного раствора цитрата натрия, если pH ниже 4,5 [9]. Рекомендовано использовать свежеприготовленный или оттаянный после замораживания при -20° С буфер, порошок СТЗ должен быть растворён в светонепроницаемой стеклянной ёмкости и введён экспериментальному животному внутривенно или внутрибрюшинно в максимально ближайшие сроки.
Негенетические модели диабетической нефропатии, воспроизводимые с помощью стрептозотоцина
На текущий момент лишь в некоторых генетических моделях ДН у грызунов описаны изменения, более-менее соответствующие всем критериям идеальной модели этого осложнения [41, 46], приведённым на официальном сайте Американского консорциума по моделям диабетических осложнений у животных (AMDCC) [16]. Тем не менее, значительные ограничения в использовании этих моделей, связанные с их высокой стоимостью, трудностями в воспроизведении, сложностями ухода, высокой степенью инбридинга и, зачастую, моногенным характером наследования СД [36], диктуют необходимость разработки, апробации и совершенствования негенетических моделей ДН у экспериментальных животных.
По данным проведённого обзора литературы, негенетические модели ДН наиболее часто воспроизводят с использованием СТЗ, вводимого аутбредным крысам. В зависимости от применяемой в эксперименте дозы цитотоксина и путей введения (внутрибрюшинно, внутривенно) у грызунов возможно моделирование различных по степени выраженности состояний углеводного обмена – от лёгких, преддиабетических изменений, до СД с абсолютной инсулиновой недостаточностью [25, 27]. При этом в большинстве используемых стрептозотоциновых моделей как СД 2 типа с умеренной гипергликемией, так и СД 1 типа с выраженной гипергликемией у крыс описывают лабораторные и морфологические признаки, характерные для ранних стадий классического течения ДН у людей [20], с не более чем 30-кратным повышением уровня альбуминурии. Однако, важность изучения патогенеза ДН и возможностей её коррекции и профилактики именно на ранних, морфофункционально обратимых стадиях, только увеличивает ценность достаточно легко воспроизводимых и относительно незатратных негенетических моделей ДН у крыс.
Моделирование диабетической нефропатии при стрептозотоциновом сахарном диабете 1 типа у крыс
Модели ДН у аутбредных крыс со стрептозотоциновым СД наиболее часто воспроизводят на самцах крыс стоков Wistar и Sprague-Dawley, при этом для моделирования СД 1 типа половозрелым крысам в возрасте 8-10 нед. (масса 200-250 г) внутривенно вводится СТЗ, растворённый в цитратной буфере (в дозировке 60 мг/кг и 55 мг/кг, соответственно). [14, 40]. Считается, что интраперитонеальный путь ведения требует большей дозы СТЗ. СТЗ вводится после 12-16 ч голода, поскольку введение препарата накормленным особям приводит к уменьшению диабетогенного эффекта СТЗ и может вызвать большой разброс экспериментальных данных из-за снижения восприимчивости животных к СТЗ на фоне постпрандиального повышения гликемии [23]. Принимая во внимание данные о возникновении выраженной отсроченной гипогликемии (вследствие временной «утечки» инсулина из разрушенных бета-клеток), возникающей через 4-8 ч после инъекции СТЗ [30], в течение 24-48 ч экспериментальные животные получают перорально 5 % раствор глюкозы. СД подтверждается при выявлении натощакового уровня гликемии выше 15 ммоль/л спустя 48 ч после инъекции СТЗ [40].
Через 8 нед. после возникновения СД наблюдается 3-4-кратное увеличение альбуминурии с одновременным снижением СКФ в 1,5 раза от первоначального, сопровождающееся появлением тубулоинтерстициального фиброза и 1,5-кратным увеличением толщины гломерулярной базальной мембраны (по данным электронной микроскопии) [26]. Длительность эксперимента в данном случае ограничивается развитием метаболических нарушений вследствие выраженной гипергликемии (более 30 ммоль/л) и инсулинопении.
С целью коррекции кетоацидоза рекомендовано назначение инсулинотерапии. Предпочтительнее применять непрерывное его введение с помощью пластыря или помпы, позволяющее добиться среднесуточного уровня глюкозы крови, близкого к нормогликемии [42]. Возможно ежедневное подкожное введение инсулина длительного действия в дозе 1-4 ед., приводящее к снижению гипергликемии до умеренных цифр (11,1-22,2 ммоль/л), что позволяет увеличить продолжительность исследования до 5-8 мес. [15, 24, 40,42]. При этом важно учитывать описанное в литературе снижение стойкого диабетогенного эффекта СТЗ, введённого в дозе 40-50 мг/кг, приводящее к спонтанной нормализации инсулин-секреторной функции при назначении инсулинотерапии в первую неделю после индукции СД [17].
Для ускорения наступления специфических диабетических изменений в почечной ткани используют хирургическую редукцию массы функционирующих нефронов. С этой целью крысам предварительно (за 3 нед. до инъекции СТЗ) производят правостороннюю нефрэктомию. В таком случае начальные признаки ДН выявляются уже в течение первого месяца после манифестации диабета, проявляющиеся гиперфильтрацией [15], значимое повышение АД отмечается на 8-й неделе, а после 8 мес. диабетического статуса – более чем 30-кратное повышение уровня экскреции альбумина с мочой относительно исходных данных, а также морфологические признаки диабетического гломерулосклероза различной степени выраженности [15, 40].
Тем не менее, данная стрептозотоциновая модель СД 1 типа у крыс имеет ряд существенных недостатков, ограничивающих её широкое использование с экспериментальной целью. Однократное введение СТЗ в высокой дозе приводит к возникновению выраженной инсулинопении и быстрой декомпенсации течения заболевания у крыс, что не позволяет проводить длительные хронические эксперименты на таких животных без введения инсулина, что существенно ограничивает её применение при исследовании сахароснижающих препаратов. Кроме того, СТЗ в высокой дозе, действуя через имеющийся в эпителиоцитах почечных канальцев вышеупомянутый глюкозный транспортёр GLUT 2, непосредственно вызывает повреждение ДНК клеток тубулярного эпителия, сохраняющееся до 4-х нед. после введения препарата [29], что необходимо учитывать при планировании длительности эксперимента и времени определения маркеров повреждения почек.
Моделирование диабетической нефропатии при стрептозотоциновом сахарном диабете 2 типа у крыс
Существенным недостатком модели ДН при стрептозотоциновом СД 1 типа является недостаточная её валидность при исследовании лекарственных средств для лечения СД 2 типа. К тому же отсутствует возможность наравне с гипергликемией оценить вклад таких серьёзных патогенетических компонентов СД 2 типа и ДН, как инсулинорезистентность, ожирение и дислипидемия. В связи с чем в экспериментальной диабетологии были разработаны несколько негенетических моделей ДН при СД 2 типа, воспроизводимого с использованием СТЗ у крыс.
Так, относительно недавно стали применяться модели геминефрэктомированных крыс с алиментарным ожирением (вызванным назначением высокожирового питания) и индукцией диабета посредством одно- или двукратного введения c недельным интервалом субдиабетических доз СТЗ (30-35 мг/кг) [21, 37]. СД 2 типа диагностируют спустя 1 нед после инъекции СТЗ посредством проведения орального глюкозотолерантного теста, в процессе которого крысам измеряют уровень гликемии натощак и через 30, 60, 90 и 120 мин. после внутрижелудочного введения 40% раствора глюкозы в дозе 3 г/кг, и уровне гликемии от 9,0 до 14,0 ммоль/л. При этом авторы описывают развитие лабораторных и морфологических признаков поздних стадий ДН на 35-40 нед эксперимента (протеинурия, снижение СКФ, диффузный гломерулосклероз). Интересно отметить, что выраженность морфологических диабетических изменений в группе крыс, получавших высокожировое питание и двукратную инъекцию СТЗ, несмотря на умеренную гипергликемию оказалась значимо выше по сравнению с крысами с СД 1 типа [45]. Однако в пилотных исследованиях по отработке обозначенной методики нам не удалось зафиксировать пороговую для СД 2 типа гипергликемию у крыс (при введении рекомендуемой в этих работах низкой дозы СТЗ (30 мг/кг) при однократном введении), а при интервальном двукратном введении СТЗ наблюдалось развитие диабета, по уровню дефицита секреции инсулина, приближающегося к абсолютной инсулинопении [2]. В связи с чем нами была апробирована модель ДН у геминефрэктомированных крыс стока Wistar, получавших в течение 5 нед. высокожировое питание, с последующей индукцией никотинамид-стрептозотоцинового СД 2 типа, в которой к 28 нед. после индукции СД развивается значимая альбуминурия и морфологические признаки ДН, выявляемые при световой микроскопии (увеличение индекса мезангиальной экспансии, артериологиалиноз, тубулоинтерстициальный фиброз), а на 16 нед., по результатам электронной микроскопии, зафиксировано значимое утолщение гломерулярной базальной мембраны [19]. Внутрибрюшинное ведение никотинамида в дозе 230 мг/кг за 15 мин. до инъекции СТЗ (65 мг/кг) минимизирует повреждающее действие цитотоксина как на бета-клетки поджелудочной железы, вызывая лишь частичную инсулинопению и стабилизацию других клинических проявлений СД [26] за счёт способности никотинамида ингибировать вышеупомянутый фермент PARP [38].
Стоит отметить, что модель стрептозотоцин-индуцированного СД 2 типа с предварительным введением никотинамида ранее успешно была применена на практике зарубежными исследователями [26] и нашими соотечественниками [11], однако, без высокожирового питания и нефрэктомии специфических лабораторно-морфологических признаков ДН у крыс в этих работах не выявлено.
Преимуществами данной модели ДН у крыс по сравнению с генетическими моделями являются широкая доступность, низкая затратность, а также относительно простая методика воспроизведения. По нашим наблюдениям, такие животные развивают ожирение, среднюю по выраженности гипергликемию, инсулинорезистентность, альбуминурию, дислипидемию и умеренную артериальную гипертензию, являющиеся основными компонентами патогенеза ДН при СД 2 типа [12].
Несмотря на большое разнообразие описанных на сегодняшний день моделей сахарного диабета у экспериментальных животных, негенетические модели стрептозотоцинового сахарного диабета по-прежнему остаются наиболее доступными, относительно легко реализуемыми и достаточно валидными, адекватно воспроизводящими обратимые стадии диабетической болезни почек у людей, когда воздействие фармакологических препаратов с нефропротективными свойствами может замедлить прогрессирование течения осложнения. Ряд имеющихся недостатков таких моделей (возможность разброса экспериментальных данных по уровню гликемии, потенциальная нефротоксичность стрептозотоцина, возможность спонтанной нормализации инсулин-секреторной функции) могут быть устранены путём правильного подбора диабетогенной дозы препарата, заблаговременного планирования протокола эксперимента и времени определения маркеров почечной дисфункции, а также посредством предварительного введения химических соединений, уменьшающих повреждающее действие цитотоксина на инсулин-секретирующие клетки (никотинамид). Кроме того, при использовании определённых схем введения стрептозотоцина у крыс с индуцированным алиментарным ожирением возможно моделирование умеренной гипергликемии, инсулинорезистентности и дислипидемии, т.е. ключевых патогенетических компонентов сахарного диабета 2 типа, а хирургическая редукция массы функционирующей почечной паренхимы может способствовать ускорению манифестации гипертензии и лабораторно-морфологических признаков диабетической нефропатии.
Работа выполнена в сотрудничестве с ресурсным центром «Развитие молекулярных и клеточных технологий» СПбГУ.
Митрейкин В.Ф., д.м.н., профессор кафедры патологической физиологии с курсом клинической патофизиологии ПСПбГМУ им. акад. И.П. Павлова, г. Санкт-Петербург;
Гринева Е.Н., д.м.н., профессор, директор Института эндокринологии ФГБУ «СЗФМИЦ», г. Санкт-Петербург.
Часть I. ОБЩАЯ ПАТОФИЗИОЛОГИЯ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ МОДЕЛИ САХАРНОГО ДИАБЕТА (CД)
МОДЕЛИ ИНСУЛИНЗАВИСИМОГО САХАРНОГО ДИАБЕТА
Авторы: Й. Меринг и О. Минковский, и независимо от них и почти одновременно, Де Доминичи (1889 г.). У животных после панкреатэктомии развивалась типичная картина ИЗСД с истощением, кетоацидозом и гибелью. О. Минковский показал, что пересадка кусочка поджелудочной железы под кожу собаки предохраняет панкреатэктомированное животное от СД.
В 1908 г. Й. Форшбах продемонстрировал на данной модели, что СД после панкреатэктомии может быть купирован при парабиотической связи кровеносной системы подопытной и интактной собак. Так в генезе СД была установлена роль нехватки неидентифицированного гормона поджелудочной железы.
Л. В. Cоболев (1901) усовершенствовал экспериментальную модель СД на собаках, предложив вызывать аутолиз экзокринной части поджелудочной железы путем перевязки ее выводного протока: в этом случае островки Лангерганса сохранялись. Разрушение экзокринных панкреацитов не приводило к развитию СД, в отличие от тотальной панкреатэктомии и удаления островков у собак с атрофированной экзокринной частью поджелудочной жедезы. Л. В. Соболев постулировал, что вещество, нехватка которого повинна в возникновении СД, вырабатывается островками Лангерганса и рекомендовал получать его путем перевязки выводного протока железы новорожденных телят, у которых экзокринная часть железы слабо развита.
Этот метод и применили Ф. Г. Бантинг, К. Х. Бест и Дж. Р. Маклеод для выделения из островков Лангерганса инсулина (1921–1922). Данное открытие было отмечено Нобелевской премией по медицине в 1923 г.
Воспроизведение панкреатэктомической модели СД у крысы долгое время не удавалось, поскольку диффузное распределение поджелудочной железы крыс по брыжейке не позволяло удалить железу целиком. Р. О. Скау в 1957 г. методически разрешил эту
ПРАКТИКУМ ПО ПАТОФИЗИОЛОГИИ
проблему (тотально удалил поджелудочную железу) и получил у крысы типичный СД. Данная модификация модели Мерин- га–Минковского развеяла миф о том, что крысы резистентны к воспроизведению сахарного диабета при помощи панкреатэктомии.
На южноамериканских жабах
В 40-х годах ХХ столетия аргентинский эндокринолог Б. А. Усай моделировал СД, удаляя поджелудочную железу у южноамериканских жаб, и показал, что проявления экспериментального СД значительно ослабевают, вплоть до полного исчезновения, если удалить аденогипофиз и надпочечники. Предварительная гипофизэктомия делает жаб значительно более резистентными к диабетогенному эффекту резекции поджелудочной железы. Эти опыты позволили установить факт продукции контринсулярных гормонов в аденогипофизе и надпо- чечниках и также удостоились Нобелевской премии по медицине (1947 г.). Впоследствии выяснили, что субтотальная резекция поджелудочной железы ведет к латентному сахарному диабету, который переходит у подопытного животного из скрытого в явный при нагрузке контринсулярными гормонами (тиреоидные, соматотропин, глюкокортикоиды) или при перекармливании углеводами.
Дж. С. Данн и Н. Г. Мак Летчи обнаружили в 1943 г., что аллоксан (уреид мезоксалевой кислоты) избирательно повреждает островковые В-клетки, вызывая их некроз, и приводит к развитию СД у крыс, мышей, кроликов и собак. Аллоксановая модель позволила установить роль собственно В-клеток в продукции инсулина, а их повреждения — в патогенезе ИЗСД. Так как аллоксан может возникать в организме эндогенно — из мочевой кислоты через диалуровую, а также в связи с частым клиниче- ским сочетанием СД и гиперурикемии, Я. А. Лазарис модифицировал аллоксановую модель и предпринял успешную попытку вызвать СД у крыс токсическими дозами мочевой кислоты (600–680 мг/кг массы тела), на фоне дефицита пищевых серусодержащих аминокислот (1957).
Часть I. ОБЩАЯ ПАТОФИЗИОЛОГИЯ
Х. Маске (1957) для моделирования ИЗСД применил дитизон (дифенилтиокарбазон) и оксином (8-оксихинолин). Это так называемые цинковые модели, поскольку действующие в них химические вещества образуют комплексы с цинком в секреторных гранулах В-клеток. Это нарушает накопление инсулина и его секрецию. Закономерно, диабет возникает лишь у кроликов, островковые В-клетки которых богаты цинком. Дитизон вводят кролику в ушную вену (100 мг на 1 кг массы животного). Через сутки после введения у кролика развивается сахарный диабет.
Еще одна «химическая» модель СД основана на применении стрептозотоцина — антибиотика, избирательно повреждающего В-клетки у крысы.
Большое значение имело установление того факта, что многие «химические» модели на деле являются химико-иммунологи- ческими . Так аллоксан, мочевая кислота и стрептозотоцин запускают против В-клеток аутоиммунный процесс.
Данные модели не воспроизводятся у тимэктомированных иммунодефицитных животных.
Развитие экспериментального СД, индуцированного хими- чески, может быть заторможено антилимфоцитарной сывороткой и иммунодепрессантами.
СД, полученный по этим моделям, подвергается адоптивному переносу при введении лимфоцитов от больных подопытных животных интактным.
В то же время некоторые химически индуцированные модели СД, например, «цинковые», иммунонезависимы.
Развитие представлений о вирусных диабетогенах неотделимо от становления вирусной модели ИЗСД. Заражение подопытных мышей М-вариантом вируса мышиного энцефаломиокардита в 40% случаев приводит к развитию аутоиммунного инсулита, оканчивающегося ИЗСД. Данная модель также блокируется тимэктомией и иммунодепрессией, т. е. носит иммунопатологиче- ский характер.
ПРАКТИКУМ ПО ПАТОФИЗИОЛОГИИ
4. СПОНТАННЫЙ САХАРНЫЙ ДИАБЕТ У ЖИВОТНЫХ ЧИСТЫХ ЛИНИЙ
Еще Г. Негели (1896) сформулировал первую генетическую гипотезу о природе СД. С обнаружением в 1974 г. Дж. Нерупом и соавт. связи между СД и генами ГКГС исследования в области генетического моделирования СД особенно активизировались.
Животные чистых линий, развивающие спонтанный СД, служат объектами эффективного изучения как ИЗСД, так и ИНСД. Подобных генетических моделей СД известно в настоящее время множество. Это чистые линии китайских хомячков, мышей ККА, мышей OB/OB и DB/DB, мышей AB/AB, колючих мышей, новозеландских мышей, песчаных крыс, крыс BB (BioBreeding), мышей NOD (Non Obese Diabetic), крыс WBH/Kobe.
У мышей NOD имеется генетическая аномалия экспрессии антигенов ГКГС 1-го класса. Это приводит к облегченной провокации аутоаллергии против панкреатических В-клеток и развитию ИЗСД. Животные характеризуются избытком Т-эффекто- ров, действующих против островковых антигенов, а также дефицитом супрессорных функций лимфоцитов.
Крысы ВВ, напротив, характеризуются наследственной лимфопенией и дефицитом цитотоксических лимфоцитов. Тем не менее они развивают спонтанный аутоиммунный инсулит, который так же, как в случае мышей NOD, приостанавливается неонатальной тимэктомией или применением иммунодепрессантов, а в естественных условиях ведет к неизбежному ИЗСД.
Крысы WBH/Кобе самопроизвольно вырабатывают в высоких титрах аутоантитела к собственному инсулину, которые повреждают В-клетки и формируют основу для развития ИЗСД.
МОДЕЛИ ИНСУЛИННЕЗАВИСИМОГО САХАРНОГО ДИАБЕТА
У мышей линий ОВ и DB развивается спонтанно ожирение, инсулинорезистентность и ИНСД. Они представляют экспериментальные модели первичного ожирения, имеющие соответственно наследственный дефект гена лептина (ОВ) или лептинового рецептора (DB). У некоторых линий спонтанно диабетических мышей обнаружено сниженное содержание переносчика глюкозы Glut 2 в островковых -клетках. При этом аномально низкий уровень переносчика Glut 2 в островковых -клетках коррелирует с ослабленной секрецией инсулина в ответ на повышение содержания глюкозы в крови.
Часть I. ОБЩАЯ ПАТОФИЗИОЛОГИЯ
Некоторые экспериментальные животные-модели инсулинорезистентного СД, по-видимому, имеют дефект хотя бы одного из белков-переносчиков глюкозы в плазматической мембране мышечных клеток.
Изучить особенности обмена веществ у кролика с экспериментальным сахарным диабетом (модель дитизонового сахарного диабета):
1. Определить наличие кетоновых тел в моче (проба Легаля)
2. Определить наличие сахара в моче (проба Фелинга).
Для исследования предлагается моча кролика, у которого был воспроизведен сахарный диабет, и моча контрольного (интактного) кролика. После проведения качественных реакций определения кетонов и сахара, делается заключение о принадлежности мочи больному или здоровому кролику.
Опыт 1. Качественная реакция определения кетоновых тел в моче (проба Легаля)
Реакция с нитропруссидом натрия дает положительный результат с ацетоуксусной килотой и ацетоном, причем реактив наиболее чувствителен к ацетоуксусной кислоте.
В пробирку наливают 0,5 мл исследуемой мочи и подщелачи- вают ее 2–3 каплями 10% раствора едкого кали.
Добавляют 3 капли 10% свежеприготовленного водного раствора нитропруссида натрия. Возникает рубиново-красное окрашивание, обусловленное присутствием в любой моче креатинина.
Добавляют 3 капли ледяной уксусной кислоты.
При наличии в моче кетонов цвет ее рубиново-красный и фиолето- во-красный. Если кетонов в моче нет — цвет становится зеленова- то-желтым.
Опыт 2. Качественная реакция определения сахара в моче (реакция Фелинга)
К 3 мл исследуемой мочи добавляют 2 мл реактива Фелинга. Пробирку взбалтывают. Верхнюю часть пробирки нагревают до кипения.
Реакция основана на способности глюкозы восстанавливать гидрат окиси меди (синего цвета) в гидрат закиси меди (желтого цвета), а затем — в закись (красный цвет).
ПРАКТИКУМ ПО ПАТОФИЗИОЛОГИИ
При наличии в моче сахара нагретая часть смеси изменяет свою окраску: синий цвет переходит в желтый или в кирпич- но-красный, а затем появляется красноватый осадок.
Реактив Фелинга: свежеприготовленная смесь реактива 1 (водный раствор сернокислой меди) и 2 (водный раствор едкого натра и сегнетовой соли).
В выводе отметить, какие метаболические нарушения зарегистрированы у подопытного кролика, каков их патогенез.
Животные, оборудование, реактивы
1. Моча интактного кролика. 2. Моча кролика с воспроизведенным дитизоновым диабетом. 3. Дитизон (дифенилтиокарбазон) — 0,5 г. 4. 10% раствор едкого кали. 5. 10% свежеприготовленный раствор нитропруссида натрия. 6. Ледяная уксусная кислота. 7. Водный раствор сернокислой меди. 8. Водный раствор едкого натра. 9. Водный раствор сегнетовой соли. 10. Пробирки стеклянные. 11. Штатив для пробирок. 12. Бюретки для реактива Фелинга и для мочи каждого из кроликов.
1. Американская диабетическая ассоциация. Диабет от А до Я / Под ред. А. С. Фокина, А. А. Фокина, Л. П. Чурилова, Ю. И. Строева. — СПб: ÝËÁÈ-ÑÏá, 2003. — 208 ñ.
2. Баранов В. Г. Экспериментальный сахарный диабет. Роль в клинической практике. Л.: Наука. — 240 с.
3. Бергер М., Старостина Е. Г., Йоргенс В., Дедов И. Практика инсулинотерапии. Берлин-Гейдельберг: Шпрингер Ферлаг, 1990. — 365 с.
4. Фелиг Ф., Бекстер Дж. Д., Бродус А. Е., Нромен Л. А. (ред.) . Эндокринология и метаболизм. — М.: Медицина, 1985. — Т. 1–2.
5. Ãåíec B. C., Ãåíec C. Ã . Патофизиология инсулинонезависимого сахарного диабета II типа // Патол. физиол. эксперим. терап. — 1993. — ¹ 10. — C. 253–304
6. Зайчик А. Ш., Утехин В. И., Чурилов Л. П., Слободской Е. В. Патофизиология сахарного диабета // В кн.: Нарушения иммунитета и метаболические расстройства. Ч.1. — СПб: Èçä-âî ÏÏÌÈ, 1995. — Ñ. 86–187.
7. Êóíå Å.-Õ. è äð . Диабет. — М.: Знание, 2001. — 176 с.
8. Строев Ю. И., Либерман И. С . Общая характеристика ангиопатий при сахарном диабете // В кн.: Генетика сахарного диабета. — Л.: Медицина, 1988. — С. 21–35.
Òåìà 11. ПАТОФИЗИОЛОГИЯ ВОДНО-ЭЛЕКТРОЛИТНОГО ОБМЕНА
Клетка является основной функциональной единицей человече- ского организма. Для выполнения специфических физиологиче- ских задач клеткам необходима устойчивая среда обитания, включая стабильное обеспечение питательными веществами и постоянное выведение продуктов метаболизма. Тщательное регулирование количества жидкости в организме способствует сохранению стабильности внутренней среды.
Водно-солевой обмен — совокупность процессов поступления воды и солей в организм, их абсорбция, распределение во внутренних средах и выделение. Различают свободную , èëè мобильную , âîäó , которая является средой, где растворены соли и белки; воду, удерживаемую коллоидами в виде так называемой воды набухания , ò. å. связанную воду , è конституционную (внутримолекулярную) воду , входящую в состав молекул белков, жиров и углеводов и освобождающуюся при их окислении. В ходе метаболи- ческих превращений вода может переходить из одного состояния в другое.
СОСТАВ ЖИДКОСТЕЙ ОРГАНИЗМА
Все жидкости организма распределяются между двумя главными жидкостными компартментами (пространствами, отсеками): внутриклеточным и внеклеточным.
Внутриклеточная жидкость . Имеются значительные разли- чия в количественном распределении воды и электролитов между внутри- и внеклеточной жидкостями. Во внутриклеточной жидкости более высокие концентрации ионов калия, магния, фосфатов и сульфата. Эти различия поддерживаются вопреки тенденции к выравниванию концентраций. Разность концентраций образует необходимые для возбудимости нервов и мышц
ПРАКТИКУМ ПО ПАТОФИЗИОЛОГИИ
биоэлектрические потенциалы. Сохранение различных концентраций калия и натрия в клетках и внеклеточных пространствах способствует созданию электрического потенциала клетки, связанного с энергией обмена веществ. Большую роль в регуляции внутриклеточного объема жидкости и ее химического состава играет клеточная мембрана, которая высокопроницаема для воды, но ее проницаемость для большинства электролитов относительно низкая. Мембраносвязанная АТФ-аза обеспечивает движение противоположно направленных потоков Na + è Ê + . Клеточная мембрана не проницаема для большинства белков, поэтому их концентрация в клетке высока. Белки представляют собой недиффундирующие анионы, т. к. мембраносвязанная Na + è Ê + -зависимая АТФ-аза обеспечивает обмен Na + è Ê + в соотношении 3:2, что предотвращает развитие относительной внутриклеточной гиперосмолярности. У взрослых на внутриклеточную жидкость приходится примерно 2/3, что для мужчины со средней массой тела (70 кг) составляет приблизительно 27 л. У младенцев же, наоборот, только половина жидкости заключена в клетках.
Внеклеточная жидкость . Основная функция внеклеточной жидкости — обеспечение клеток питательными веществами и удаление продуктов обмена. Поддержание нормального объема внеклеточного пространства, особенно внутрисосудистой жидкости, очень важно для нормального функционирования организма. Во внеклеточной жидкости представлены в основном ионы натрия, хлора и гидрокарбоната. Натрий — основной катион и осмотически активный компонент внеклеточной жидкости, поэтому именно концентрация натрия определяет объем внеклеточной жидкости. Следовательно, изменения объема внеклеточной жидкости сопряжены с изменениями общего содержания натрия в организме, что, в свою очередь, определяется поступлением натрия в организм, его экскрецией почками и внепочечными потерями. Внеклеточная жидкость подразделяется на несколько типов: интерстициальную, внутрисосудистую и трансцеллюлярную.
Интерстициальная (межуточная) — жидкость, окружающая клетки. Интерстициальную жидкость можно рассматривать как ультрафильтрат плазмы. Через поры капиллярного эндотелия в норме проходит лишь незначительное количество белков плазмы, поэтому концентрация белка в интерстициальной жидкости
Часть I. ОБЩАЯ ПАТОФИЗИОЛОГИЯ
относительно низка (4 г/л), а общий состав электролитов соответствует составу плазмы. Белки, попавшие в интерстициальное пространство, возвращаются в сосудистое русло с лимфой. В норме очень небольшое количество интерстициальной жидкости находится в свободном состоянии. Большая часть интерстициальной воды химически связана с протеогликанами, формируя гель. Давление интерстициальной жидкости обычно отрицательное (около –5 мм рт. ст.). При увеличении объема интерстициальной жидкости ее давление повышается. Когда интерстициальное давление становится положительным, содержание свободной воды в геле быстро увеличивается, клинически это проявляется отеком. Количество интерстициальной жидкости у взрослых составляет примерно 11–12 л. По отношению к массе тела объем интерстициальной жидкости у новорожденного приблизительно в 2 раза больше, чем у взрослого. При кровопотере, а также при передозировке жидкости интерстициальная жидкость выступает в роли объемного буфера.
Внутрисосудистая жидкость — внутрисосудистая жидкость (плазма) отграничена эндотелиоцитами кровеносных сосудов. Большинство электролитов (в основном ионы небольшого размера) свободно проходят через эндотелий, чем объясняется поч- ти идентичный электролитный состав плазмы и интерстициальной жидкости. Вместе с тем плотные контакты эндотелиальных клеток препятствуют выходу белков плазмы за пределы сосудистого русла. Таким образом, белки плазмы (преимущественно альбумин) являются основным осмотически активным компонентом, обеспечивающим обмен жидкости между плазмой и интерстициальным пространством. В норме увеличение объема внеклеточной жидкости обеспечивается за счет пропорционального увеличения объема плазмы и интерстициальной жидкости. Таким образом, интерстициальное пространство служит своего рода компенсирующим резервуаром и для внутрисосудистого пространства.
Трансцеллюлярная жидкость содержится в специализированных полостях тела. К трансцеллюлярной жидкости относятся спинномозговая, перикардиальная, плевральная, синовиальная и внутриглазная, а также пищеварительные соки. В норме она составляет 2,4% массы тела. Объем трансцеллюлярной жидкости примерно 2 л. Эти жидкости являются секретами желез, находятся в различных полостях и существенно отличаются по хими-
ПРАКТИКУМ ПО ПАТОФИЗИОЛОГИИ
ческому составу. В течение суток выделяется до 8 л таких жидкостей, которые практически полностью подвергаются реабсорбции. Это равновесие может нарушаться, например, при кишечной непроходимости, когда большое количество жидкости и электролитов выводится в кишечную петлю.
ФАКТОРЫ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИЕ ДВИЖЕНИЕ ВОДЫ И РАСТВОРЕННЫХ ВЕЩЕСТВ ЧЕРЕЗ МЕМБРАНЫ
Каждый жидкостный компартмент отделен селективно проницаемой мембраной, допускающей движение воды и некоторых растворенных в ней компонентов. К полупроницаемым мембранам организма относятся:
клеточные мембраны , разделяющие внутриклеточную и интерстициальную жидкость и состоящие из липидов и белка;
капиллярные мембраны , разделяющие внутрисосудистую и
эпителиальные мембраны , отделяющие внутрисосудистую и интерстициальную жидкость от трансцеллюлярной.
Кроме мембранной селективности, движение воды и растворенных веществ определяется несколькими транспортными процессами.
Диффузия — это хаотическое движение молекул, обусловленное их кинетической энергией. В результате диффузии в основном происходит перемещение воды и электролитов между жидкостными компартментами. Простая диффузия невозможна при отсутствии благоприятного электрического или концентрационного градиента.
Активный транспорт . Необходим для перемещения субстанции из области с меньшей или эквивалентной концентрацией в область с эквивалентной или большей концентрацией. Для осуществления активного транспорта требуется энергия. Активный транспорт жизненно необходим для поддержания уникального состава как внеклеточной, так и внутриклеточной жидкостей.
Фильтрация — это движение воды и растворенных веществ из области с высоким гидростатическим давлением в область с низким гидростатическим давлением. Гидростатическое давле-