Хирургическая модель
Впервые экспериментально сахарный диабет путем удаления поджелудочной железы удалось получить и официально обосновать физиологам Оскару Минковскому и Жозефу ван Мерингу. В научных достижениях наряду с упорным трудом играет немаловажную роль такое качество как интуиция – удивительная способность искать одну вещь и в процессе находить другую. Блестящий научный эксперимент Минковского как нельзя лучше иллюстрирует это утверждение. Ученый так описывал эту ситуацию: он и его коллега в университете Страсбурга Жозеф ван Меринг обсуждали следующий вопрос – являются ли свободные жирные кислоты необходимыми для всасывания жиров, вопрос, которым в то время занимался ван Меринг. Поджелудочная железа, по его мнению, играла главную роль в этом процессе, и ван Меринг попытался решить вопрос путем перевязывания панкреатических протоков, тем не менее без всякого успеха. Минковский предложил провести тотальную панкреатэктомию для доказательства теории ван Меринга, операцию, выполнение которой последний считал невозможным. Тем не менее, Минковский, имея уже опыт удаления печени у птиц, попросил ван Меринга подготовить собаку для эксперимента, что было выполнено в тот же день, и ван Меринг ассистировал Минковскому в проведении операции. Панкреатэктомия, без какой-либо специальной подготовки, была выполнена успешно, и проопериванную собаку было решено использовать для изучения ван Мерингом жирового обмена, однако впоследствии коллега Минковского вынужден был несколько дней отсутствовать в лаборатории. Естественно, ни у кого из них не было и мысли о развитии диабета после панкреатэктомии. Во время отсутствия ван Меринга, произошло нечто, что коренным образом изменило ход медицинской науки. Как сам Минковский впоследствии сообщал о полученных результатах: после экстирпации поджелудочной железы у собаки появился сахарный диабет. Он развился через пару дней после операции и длился несколько недель, пока не наступила гибель животного. Отмечалась глюкозурия в сочетании с полиурией, выраженный голод, потеря веса и астения несмотря на достаточное обеспечение питательными веществами. Моча экспериментальных животных также содер жала некоторое количество ацетона. Уровень сахара крови был значительно повышен, у одной собаки он достиг уровня 0,3%, у другой – 0,46%. Запас гликогена в органах практически исчезал. Солнечное сплетение в процессе операции не было повреждено, следовательно, развитие диабета было связано непосредственно с удалением поджелудочной железы. Переливание крови собак с диабетом здоровой особи не приводило к глюкозурии у последней. Интересно, что Минковский совершил свое открытие более чем за десять лет до того, как благодаря работам ученого Старлинга был введен термин «гормон» и появилось такое понятие, как «физиология эндокринной системы». В ходе эксперимента Минковским, а затем и другими учеными был доказан очевидный факт – отсутствие поджелудочной железы является необходимой предпосылкой для развития сахарного диабета. Однако механизм этого явления долгое время оставался неясным.
Химическая модель
а) аллоксановый диабет
Наибольшее распространение в современной экспериментальной диабетологии получили химические модели сахарного диабета.
Аллоксан является продуктом распада мочевой кислоты и представляет собой белое кристаллическое вещество, розовеющее на воздухе. Средство обладает диабетогенным действием только при парентеральном способе введения – внутривенном, подкожном, внутримышечном и интраперитонеальном. Оно используется для изучения сахарного диабета типа 1. Эффективная доза зависит от вида животного, способа введения и состояния питания. Для мышей и крыс чаще употребляется внутрибрюшинное введение моногидрата аллоксана однократно в виде 0,9 % нормального солевого раствора в дозе 150 мг/кг или внутривенное введение в виде 5 % водного раствора в дозе 65 мг/кг. Экспериментальная доза должна быть тщательно подобрана, чтобы избежать чрезмерного повреждения панкреатической ткани. У исследованных животных после введения ал локсана в диабетогенных дозах выявляется развитие трехфазной или четырехфазной гликемической кривой. Согласно авторам, первая скоротечная гипогликемическая фаза длительноcтью максимально 30 мин. начинается с первых минут после введения аллоксана. Этот короткий гипогликемический ответ – результат быстрой стимуляции секреции инсулина, который подтверждается увеличением его концентрации в плазме крови. Механизм этой гиперинсулинемии временное увеличение АТФ, обусловленное торможением фосфорилирования глюкозы вследствие угнетения глюкокиназы. Вторая фаза гликемической кривой начинается с подъема концентрации глюкозы через один час после введения аллоксана. Это первая гипергликемическая фаза после контакта В-клеток с токсином. Гипергликемия обычно остается на протяжении 2-4 часов и обусловлена уменьшением концентрации инсулина плазмы в связи с угнетением его секреции панкреатическими В-клетками. Однако есть и другие мнения. Ряд авторов считает гипергликемию следствием стресc-реакции со стороны надпочечников, отвечающих повышенным выделением адреналина или же влиянием глюкагона и гормонов гипоталамуса. Спустя 4-8 часов (по некоторым авторам 6-12 часов) после введения аллоксана наступает третья фаза гликемической кривой, характеризующаяся глубокой гипогликемией, продолжающейся до суток. Иногда без инъекции глюкозы она может закончиться судорогами и смертью животных. Высокая летальность подопытных животных – основной недостаток экспериментального моделирования сахарного диабета путем введения аллоксана. Согласно подавляющему большинству работ, гипогликемия обусловлена освобождением в кровь инсулина из разрушающихся В-клеток. Как подтверждает морфометрический и ультраструктурный анализ, изменения охватывают не только секреторные гранулы с потерей их содержимого, но и плазмолемму, компоненты ядра и многие субклеточные органеллы (гладкую эндоплазматическую сеть, комплекс Гольджи, митохондрии), нередко они заканчиваются некрозом В-клеток. Если животные в предыдущей стадии не погибают, то возникает вторичная устойчивая гипергликемия, которая свидетельствует о развитии диабета. Она рассматривается как четвертая, финальная фаза гликемической кривой, характеризующей аллоксановый диабет. Морфологические и ультрамикроскопические данные свидетельствуют о полной дегрануляции и потере целостности В-клеток. Другие эндокринные клетки, как и клетки экзокринной паренхимы, остаются интактными, подтверждая избирательный характер поражения В-клеток этим токсином. Патогенез экспериментального аллоксанового диабета можно представить как последовательность взаимодействия значительного количества факторов, совокупное действие которых приводит к деструкции, уменьшению количества В-клеток и диабетогенному эффекту.
б) стрептозотоциновый диабет
Среди химических моделей экспериментального диабета стрептозотоциновая наряду с аллоксановой является наиболее распространенной. Стрептозотоцин (стрептозоцин, изостоцин, занозар) — синтетический препарат, полученный из микроорганизмов Streptomyces achromogenes, откуда и произошло его название. Стрептозотоцин является токсическим соединением из группы производных нитрозомочевины, избирательно проникающим в панкреатические бета-клетки посредством переносчика GLUT-2. Его панкреатотоксичность в значительной мере связывают с алкилирующей активностью его метильной группы, которая способна вызывать дефицит запасов кофактора NAD+, а затем и энергетических субстратов в виде АТФ, что неминуемо приводит, в конечном счёте, к некрозу бета-клеток. Данный процесс усугубляется
активацией свободнорадикального окисления, связанного с генерацией пероксинитрита из избыточно образующегося оксида азота, донатором которого является нитрозогруппа стрептозотоцина. Диабетогенный эффект наблюдается у многих видов животных, включая мышей, собак, кошек, обезьян, морских свинок и др. Наиболее резистентными оказались кролики и свиньи, а максимальная сенсибилизация выявлена у крыс, при этом оптимальная диабетогенная доза для крысы уменьшается по мере увеличение массы животного. Замечено, что при использовании высоких цитотоксических доз стрептозотоцина первоначальные функциональные изменения постепенно переходят в серьезные нарушения. Они носят более общий и неспецифический характер и, прогрессируя, приводят к гибели клеток. В случае применения более низких доз стрептозотоцина многие В-клетки способны выдержать первоначальное воздействие, но длительное время обнаруживают снижение функции в результате недостаточного окислительного метаболизма митохондрий. Также отмечено, что особи мужского пола при сопоставимой дозе развивают более выраженную гипергликемию. Для получения экспериментального диабета существует несколько способов введения препарата в организм: внутривенный, внутрибрюшинный и метод прямой инфузии в сосуды поджелудочной железы. В связи с неустойчивостью стрептозотоцина и коротким периодом его полураспада самым надежным считается внутривенное введение.
Каковы же изменения концентрации глюкозы крови в ответ на введение препарата? Они носят трехфазный характер. В отличие от воздействия аллоксаном не развивается начальная скоротечная гипогликемическая фаза, обусловленная торможением фосфорилирования глюкозы в результате угнетения глюкокиназы. Установлено, что стрептозотоцин не угнетает глюкокиназу. Первая гипергликемическая фаза начинается через 1 час после введения стрептозотоцина, достигая пика подъема глюкозы через 2 часа и продолжается до 4-х часов. О причинах развития ранней гипергликемии имеются разные мнения. Большинство авторов считают её результатом угнетения секреции инсулина, вызванной токсическим воздействием стрептозотоцина на В-клетки поджелудочной железы, что приводит к нарушению синтеза проинсулина и инсулина. Некоторые авторы связывают её с повышением скорости печеночного гликогенолиза или рассматривают как вторичную по отношению к повышению содержания свободных жирных кислот. Следующая, гипогликемическая, фаза наступает спустя 4-8 часов после введения стрептозотоцина и продолжается в течение нескольких часов (до суток). По единодушному мнению авторов, она считается следствием освобождения инсулина из поврежденных В-клеток. Третья фаза гликемической кривой является финальной и характеризуется устойчивой гипергликемией и развитием перманентного стрептозотоцинового диабета, наблюдающегося через 24 часа после введения препарата. Морфологический и ультрамикроскопический анализ свидетельствует о полной дегрануляции и потере целостности В-клеток.
в) дитизоновый диабет
Является наиболее известным среди моделей, так называемого, «цинкового» диабета. Чтобы понять механизм его моделирования, нужно знать биологическую роль цинка относительно рассматриваемой нами темы. Итак, цинк является составной частью каталитически активного центра целого ряда ферментов – дегидрогеназы, карбоксипептидазы, трансфорилазы. Определенное количество ионов цинка содержится в панкреатических островках человека, кроликов, собак, мышей, крыс, котов и других животных, исключая морских свинок. С помощью гистохимических методов было показано, что цинк находится в тесной функциональной связи с инсулином непосредственно в секреторных гранулах, образуя специфические нерастворимые комплексы депонированного гормона. Под влиянием стимуляторов секреции инсулина происходит изменение характера связи и нерастворимый комплекс цинк-инсулин становится растворимым. При введении глюкозы количество цинка в В-клетках уменьшается, почти полностью исчезая при длительной нагрузке глюкозой. Установлено, что любые вещества, вступающие в соединения с цинком и нарушающие его связь с инсулином, могут обладать диабетогенным действием. Таким образом, дитизон блокирует в островках поджелудочной железы цинк, в результате чего происходит разрушение В-клеток.
Теперь перейдем непосредственно к механизму моделирования дитизонового диабета. Дитизон, химически представляющий собой дифенилтиокарбазон, рекомендуется вводить в водном растворе аммиака. Наилучшим объектом для изучения дитизонового диабета являются кролики, хотя удалось вызвать его и у мышей. Предварительное голодание животных в течение 1-2 суток значительно повышает их чувствительность к дитизону, как и к остальным диабетогенным веществам. Через 2-5 мин. после введения дитизон соединяется с цинком в панкреатических В-клетках, образуя дитизонат цинка. В первые сутки после введения диабетогенной дозы дитизона происходит трехфазное колебание концентрации сахара в крови, аналогичное описанному при аллоксановом диабете. Оно сопровождается структурными изменениями В-клеток. Первые изменения в виде небольших очагов опустошения цитоплазмы В-клеток начинают развиваться уже через 15 минут после образования комплекса цинк – дитизон. Через 30 мин. после введения дитизона наблюдается первая фаза — гипергликемия, достигающая максимума через 1-3 часа, обусловленная мобилизацией гликогена из печени. Вторая, гипогликемическая, фаза обусловлена выходом в кровь инсулина из разрушающихся В-клеток. Максимум гипогликемии наступает через 8-18 часов после введения дитизона. В случае тяжелой гипогликемии животные иногда погибают при явлениях жестоких судорог. Глубина гипогликемии позволяет судить о тяжести развивающегося в дальнейшем дитизонового диабета. Через 24-28 часов появляется вторичная гипогликемия и развивается диабет, характеризующийся стойкой гипергликемией, гликозурией, полиурией, полидипсией и полифагией.
Различают 3 типа течения дитизонового диабета. Первый тип характеризуется острым развитием заболевания. Кролики погибали через 5-7 дней после введения дитизона при явлениях, напоминавших диабетическую кому. Второй тип характеризуется хроническим течением заболевания, что наблюдалось у большинства животных. Они могли жить без введения инсулина свыше 400 дней. Третий тип заболевания характеризовался спонтанным выздоровлением от дитизонового диабета. Уровень глюкозы в крови приходил к норме, исчезал сахар из мочи, нарастал вес животных. При гистологическом исследовании поджелудочной железы можно было подтвердить восстановление инкреторной функции островковой ткани. У выздоровевших животных обнаруживали пылевидную зернистость, заполнявшую апикальную или назальную часть клеток или располагавшуюся в виде пристеночной каемочки. Зернистость была выражена значительно слабее, чем у интактных животных, но, по-видимому, образовывалась в количестве, достаточном для удовлетворения потребности организма в инсулине. Новообразование В-клеток обнаруживалось в эпителии протоков и в экзокринной ткани. Обнаруживали митотические деления В-клеток, свидетельствующие о репаративных процессах в островковой ткани.
Итак, мы рассмотрели хирургическую модель и основные химические модели экспериментального сахарного диабета и можем сделать вывод, что среди представленных моделей предпочтение отдается стрептозотоциновому диабету. Преимущество его заключается в относительной простоте воспроизведения, чего нельзя сказать о панкреатэктомии, высокой избирательности воздействия, возможности получения диабета различной степени тяжести и длительности, что позволяет смоделировать как постепенно развивающуюся дисфункцию В-клеток, так и нарушение толерантности к глюкозе и развитие связанных с ней расстройств. «Цинковые» формы диабета являются удобной моделью вследствие простоты их получения, незначительных побочных явлений на другие органы и ткани. Однако недостатком данной модели является ограниченный выбор животных. Что же касается аллоксанового диабета, то главным недостатком этой модели, как упоминалось нами выше, является высокая летальность подопытных животных.
Эндокринная модель
Эндокринные модели сахарного диабета основаны на действии контринсулярных гормонов. Моделирование этим путем осложняется тем, что, кроме гипофиза и надпочечников, многие железы внутренней секреции (щитовидная, поджелудочная железа) также влияют на углеводный обмен и могут содействовать развитию сахарного диабета.
а) стероидный диабет
Моделирование стероидного диабета на подопытных животных актуально, т.к. позволяет изучить течение этого заболевания у людей. Эндогенный стероидный диабет у людей возникает при заболеваниях, обусловленных избыточной активностью АКТГ, вторичным гиперкортицизмом или первичным гиперкортицизмом, связанным с кортикостеромой. Экзогенный стероидный диабет возникает при длительном лечении препаратами глюкокортикоидов больных, например, ревматоидным артритом, бронхиальной астмой, коллагенозами.
С целью изучения заболевания у людей проводится экспериментальное моделирование на животных путём введения им кортизона. У кроликов, получавших кортизон, наблюдалось развитие стероидного диабета, так как усиливается глюконеогенез, тормозится окисление глюкозы и образование из нее жира. Для данного диабета характерна начальная гиперинсулинемия, что обсуловлено дегрануляцией В-клеток и повышением их митотической активности, затем зафиксировано снижение чувствительности к инсулину (инсулинорезистентность) и последующее поражение инсулярного аппарата с возникновением классического синдрома инсулинодефицитного диабета.
б) гипофизарный диабет
Способность вызывать гипергликемию и глюкозурию приписывают также и соматотропному гормону передней доли гипофиза. Длительное введение соматотропного гормона в организм усиливает образование в печени глюкозы из аминокислот и жиров, а также угнетает потребление глюкозы тканями. Гипергликемическое действие соматотропного гормона оказывает сначала стимулирующее влияние на инсулярные клетки поджелудочной железы, которое в конце концов приводит к истощению B-клеток.
Введение собакам парентерально экстракта из передней доли гипофиза в течение 2 — 3 недель вызывает заметную гипергликемию с глюкозурией и кетонемию. При этом в островковом аппарате обнаруживаются дегенеративные изменения. Участие гипофиза в расстройствах углеводного обмена видно также из того, что удаление железы вызывает гипогликемию, особенно у голодающего животного. Если же сначала вызвать панкреатическую глюкозурию, а затем удалить гипофиз, то проявление глюкозурии значительно ослабевает.
Иммунная модель
Как нам известно, одной из причин сахарного диабета I типа является аутоиммунное нарушение. При этом организм вырабатывает антитела против собственного инсулина, а также против клеток островков Лангерханса. В результате возникает аутоиммунное повреждение В-клеток поджелудочной железы, приводящее к абсолютной недостаточности инсулина в организме.
На основе этих процессов экспериментально моделируют сахарный диабет I типа у подопытных животных путем введения описанных выше антител. Недостаток данного метода заключается прежде всего в сложности получения необходимых антител по сравнению с теми же химическими моделями, где получить вещества гораздо проще.
Папиллярные узоры пальцев рук — маркер спортивных способностей: дерматоглифические признаки формируются на 3-5 месяце беременности, не изменяются в течение жизни.
Опора деревянной одностоечной и способы укрепление угловых опор: Опоры ВЛ — конструкции, предназначенные для поддерживания проводов на необходимой высоте над землей, водой.
Организация стока поверхностных вод: Наибольшее количество влаги на земном шаре испаряется с поверхности морей и океанов (88‰).
Несмотря на достигнутые успехи в лечении пациентов с сахарным диабетом (СД), диабетическая нефропатия по-прежнему остаётся одной из основных причин заболеваемости и смертности пациентов с сахарным диабетом [1], как и десятилетие назад [5], принося национальной системе здравоохранения значительные социально-экономические потери [4]. Являясь самостоятельной лидирующей причиной терминальной стадии хронической болезни почек в большинстве стран мира, диабетическая нефропатия (ДН), трактуемая с 2007 г. как диабетическая болезнь почек [3], с течением времени развивается по меньшей мере у трети пациентов с СД [13] и в своём классическом течении проходит прогрессию от стадии нормоальбуминурии через микроальбуминурию до макроальбуминурии / протеинурии и снижения скорости клубочковой фильтрации (СКФ) [34]. Важным с точки зрения понимания патофизиологических механизмов возникновения и прогрессирования ДН и разработки профилактических и лечебных подходов является использование адекватных моделей ДН у экспериментальных животных, максимально точно воспроизводящих стадии естественного течения этого микрососудистого осложнения СД у людей.
Типы моделей сахарного диабета у экспериментальных животных
Поскольку для возникновения ДН необходимо наличие гипергликемии (о чём свидетельствует отсутствие подобных почечных изменений у пациентов без СД), в основе воспроизведения ДН как при СД 1 типа, так и при СД 2 типа у экспериментальных животных лежит индукция гипергликемического состояния.
Существует множество моделей спонтанного развития у грызунов СД 1 типа (биобридинговые, LETL, WBN/Kob крысы, NOD-мыши и др.) и 2 типа (крысы и мыши с дефектом синтеза лептина или лептинового рецептора и др.), полученные в результате передаваемых по наследству генетических мутаций или отобранные из аутбредных животных без диабета (например, крысы Goto-Kakizaki, мыши Tsumara Suzuki и др.) [7, 10]. СД может быть вызван хирургическим путём (посредством частичной или тотальной панкреатэктомии, классическим примером которой является эксперимент О. Минковского и Й. Меринга на собаках [8], фармакологическими препаратами (вызывающими деструкцию секретирующих инсулин бета-клеток поджелудочной железы [30]), посредством использования методов генной инженерии (технологии «нокаута» и трансгенной гиперэкспрессии специфических генов [7]), назначением специальных диетических рационов [6, 35], а также различными вариантами их сочетания.
Тем не менее, несмотря на довольно обширный выбор моделей СД у животных, во многих экспериментальных лабораториях для моделирования осложнений заболевания, в т.ч. ДН, используется введение диабетогенного цитотоксина стрептозотоцина (СТЗ) [43].
Механизм диабетогенного действия стрептозотоцина
Стрептозотоцин является токсическим соединением из группы производных нитрозомочевины, связанным в С2 положении с D-глюкозой [29], избирательно проникающим в панкреатические бета-клетки посредством переносчика GLUT-2 [28]. Панкреатотоксичность СТЗ в значительной мере связывают с алкилирующей активностью его метильной группы, приводящей к фрагментации ДНК бета-клеток, в ответ на которую активируется участвующий в репарации повреждённой ДНК фермент поли (АДФ-рибоза) полимераза (PARP). Развивающийся в связи с этим дефицит запасов кофактора NAD+, а затем и энергетических субстратов в виде АТФ, неминуемо приводит, в конечном счёте, к некрозу бета-клеток [44]. Данный процесс усугубляется активацией свободнорадикального окисления, связанного с генерацией пероксинитрита из избыточно образующегося оксида азота, донатором которого является нитрозогруппа СТЗ [39].
Диабетогенный эффект СТЗ наблюдается у многих видов животных, включая мышей, собак, кошек, обезьян, морских свинок и др. Наиболее резистентными к действию СТЗ оказались кролики и свиньи, а максимальная сенсибилизация выявлена у крыс, при этом оптимальная диабетогенная доза СТЗ для крысы уменьшается по мере увеличение массы животного. [18, 22, 33] Также отмечено, что особи мужского пола при сопоставимой дозе развивают более выраженную гипергликемию [32].
Технология приготовления цитратного буфера и раствора стрептозотоцина
Порошок стрептозотоцина, который до использования должен храниться в защищённом от света пластиковом флаконе с осушителем при температуре -20° С, растворяют в натриевом цитратном буфере с pH 4,5. Для приготовления раствора цитратного буфера с требуемым pH 4,5 необходимо: 1) смешать 47 мл 0,1 М раствора лимонной кислоты (содержит 21,01 г/л моногидрата лимонной кислоты) и 53 мл 0,1 М раствора тринатриевой соли лимонной кислоты (содержит 29,41 г/л дигидрата тринатриевой соли); 2) довести содержимое раствора до 950-970 мл дистиллированной водой, перемешать мешалкой; 3) аккуратно довести объём раствора до 1000 мл, параллельно измеряя рН-метром pH получившегося раствора. 4) Если рН раствора выше 4,5, добавить несколько капель 0,1 М раствора лимонной кислоты (2,1 гр цитрата довести до объёма 10 мл), или добавить несколько капель водного раствора цитрата натрия, если pH ниже 4,5 [9]. Рекомендовано использовать свежеприготовленный или оттаянный после замораживания при -20° С буфер, порошок СТЗ должен быть растворён в светонепроницаемой стеклянной ёмкости и введён экспериментальному животному внутривенно или внутрибрюшинно в максимально ближайшие сроки.
Негенетические модели диабетической нефропатии, воспроизводимые с помощью стрептозотоцина
На текущий момент лишь в некоторых генетических моделях ДН у грызунов описаны изменения, более-менее соответствующие всем критериям идеальной модели этого осложнения [41, 46], приведённым на официальном сайте Американского консорциума по моделям диабетических осложнений у животных (AMDCC) [16]. Тем не менее, значительные ограничения в использовании этих моделей, связанные с их высокой стоимостью, трудностями в воспроизведении, сложностями ухода, высокой степенью инбридинга и, зачастую, моногенным характером наследования СД [36], диктуют необходимость разработки, апробации и совершенствования негенетических моделей ДН у экспериментальных животных.
По данным проведённого обзора литературы, негенетические модели ДН наиболее часто воспроизводят с использованием СТЗ, вводимого аутбредным крысам. В зависимости от применяемой в эксперименте дозы цитотоксина и путей введения (внутрибрюшинно, внутривенно) у грызунов возможно моделирование различных по степени выраженности состояний углеводного обмена – от лёгких, преддиабетических изменений, до СД с абсолютной инсулиновой недостаточностью [25, 27]. При этом в большинстве используемых стрептозотоциновых моделей как СД 2 типа с умеренной гипергликемией, так и СД 1 типа с выраженной гипергликемией у крыс описывают лабораторные и морфологические признаки, характерные для ранних стадий классического течения ДН у людей [20], с не более чем 30-кратным повышением уровня альбуминурии. Однако, важность изучения патогенеза ДН и возможностей её коррекции и профилактики именно на ранних, морфофункционально обратимых стадиях, только увеличивает ценность достаточно легко воспроизводимых и относительно незатратных негенетических моделей ДН у крыс.
Моделирование диабетической нефропатии при стрептозотоциновом сахарном диабете 1 типа у крыс
Модели ДН у аутбредных крыс со стрептозотоциновым СД наиболее часто воспроизводят на самцах крыс стоков Wistar и Sprague-Dawley, при этом для моделирования СД 1 типа половозрелым крысам в возрасте 8-10 нед. (масса 200-250 г) внутривенно вводится СТЗ, растворённый в цитратной буфере (в дозировке 60 мг/кг и 55 мг/кг, соответственно). [14, 40]. Считается, что интраперитонеальный путь ведения требует большей дозы СТЗ. СТЗ вводится после 12-16 ч голода, поскольку введение препарата накормленным особям приводит к уменьшению диабетогенного эффекта СТЗ и может вызвать большой разброс экспериментальных данных из-за снижения восприимчивости животных к СТЗ на фоне постпрандиального повышения гликемии [23]. Принимая во внимание данные о возникновении выраженной отсроченной гипогликемии (вследствие временной «утечки» инсулина из разрушенных бета-клеток), возникающей через 4-8 ч после инъекции СТЗ [30], в течение 24-48 ч экспериментальные животные получают перорально 5 % раствор глюкозы. СД подтверждается при выявлении натощакового уровня гликемии выше 15 ммоль/л спустя 48 ч после инъекции СТЗ [40].
Через 8 нед. после возникновения СД наблюдается 3-4-кратное увеличение альбуминурии с одновременным снижением СКФ в 1,5 раза от первоначального, сопровождающееся появлением тубулоинтерстициального фиброза и 1,5-кратным увеличением толщины гломерулярной базальной мембраны (по данным электронной микроскопии) [26]. Длительность эксперимента в данном случае ограничивается развитием метаболических нарушений вследствие выраженной гипергликемии (более 30 ммоль/л) и инсулинопении.
С целью коррекции кетоацидоза рекомендовано назначение инсулинотерапии. Предпочтительнее применять непрерывное его введение с помощью пластыря или помпы, позволяющее добиться среднесуточного уровня глюкозы крови, близкого к нормогликемии [42]. Возможно ежедневное подкожное введение инсулина длительного действия в дозе 1-4 ед., приводящее к снижению гипергликемии до умеренных цифр (11,1-22,2 ммоль/л), что позволяет увеличить продолжительность исследования до 5-8 мес. [15, 24, 40,42]. При этом важно учитывать описанное в литературе снижение стойкого диабетогенного эффекта СТЗ, введённого в дозе 40-50 мг/кг, приводящее к спонтанной нормализации инсулин-секреторной функции при назначении инсулинотерапии в первую неделю после индукции СД [17].
Для ускорения наступления специфических диабетических изменений в почечной ткани используют хирургическую редукцию массы функционирующих нефронов. С этой целью крысам предварительно (за 3 нед. до инъекции СТЗ) производят правостороннюю нефрэктомию. В таком случае начальные признаки ДН выявляются уже в течение первого месяца после манифестации диабета, проявляющиеся гиперфильтрацией [15], значимое повышение АД отмечается на 8-й неделе, а после 8 мес. диабетического статуса – более чем 30-кратное повышение уровня экскреции альбумина с мочой относительно исходных данных, а также морфологические признаки диабетического гломерулосклероза различной степени выраженности [15, 40].
Тем не менее, данная стрептозотоциновая модель СД 1 типа у крыс имеет ряд существенных недостатков, ограничивающих её широкое использование с экспериментальной целью. Однократное введение СТЗ в высокой дозе приводит к возникновению выраженной инсулинопении и быстрой декомпенсации течения заболевания у крыс, что не позволяет проводить длительные хронические эксперименты на таких животных без введения инсулина, что существенно ограничивает её применение при исследовании сахароснижающих препаратов. Кроме того, СТЗ в высокой дозе, действуя через имеющийся в эпителиоцитах почечных канальцев вышеупомянутый глюкозный транспортёр GLUT 2, непосредственно вызывает повреждение ДНК клеток тубулярного эпителия, сохраняющееся до 4-х нед. после введения препарата [29], что необходимо учитывать при планировании длительности эксперимента и времени определения маркеров повреждения почек.
Моделирование диабетической нефропатии при стрептозотоциновом сахарном диабете 2 типа у крыс
Существенным недостатком модели ДН при стрептозотоциновом СД 1 типа является недостаточная её валидность при исследовании лекарственных средств для лечения СД 2 типа. К тому же отсутствует возможность наравне с гипергликемией оценить вклад таких серьёзных патогенетических компонентов СД 2 типа и ДН, как инсулинорезистентность, ожирение и дислипидемия. В связи с чем в экспериментальной диабетологии были разработаны несколько негенетических моделей ДН при СД 2 типа, воспроизводимого с использованием СТЗ у крыс.
Так, относительно недавно стали применяться модели геминефрэктомированных крыс с алиментарным ожирением (вызванным назначением высокожирового питания) и индукцией диабета посредством одно- или двукратного введения c недельным интервалом субдиабетических доз СТЗ (30-35 мг/кг) [21, 37]. СД 2 типа диагностируют спустя 1 нед после инъекции СТЗ посредством проведения орального глюкозотолерантного теста, в процессе которого крысам измеряют уровень гликемии натощак и через 30, 60, 90 и 120 мин. после внутрижелудочного введения 40% раствора глюкозы в дозе 3 г/кг, и уровне гликемии от 9,0 до 14,0 ммоль/л. При этом авторы описывают развитие лабораторных и морфологических признаков поздних стадий ДН на 35-40 нед эксперимента (протеинурия, снижение СКФ, диффузный гломерулосклероз). Интересно отметить, что выраженность морфологических диабетических изменений в группе крыс, получавших высокожировое питание и двукратную инъекцию СТЗ, несмотря на умеренную гипергликемию оказалась значимо выше по сравнению с крысами с СД 1 типа [45]. Однако в пилотных исследованиях по отработке обозначенной методики нам не удалось зафиксировать пороговую для СД 2 типа гипергликемию у крыс (при введении рекомендуемой в этих работах низкой дозы СТЗ (30 мг/кг) при однократном введении), а при интервальном двукратном введении СТЗ наблюдалось развитие диабета, по уровню дефицита секреции инсулина, приближающегося к абсолютной инсулинопении [2]. В связи с чем нами была апробирована модель ДН у геминефрэктомированных крыс стока Wistar, получавших в течение 5 нед. высокожировое питание, с последующей индукцией никотинамид-стрептозотоцинового СД 2 типа, в которой к 28 нед. после индукции СД развивается значимая альбуминурия и морфологические признаки ДН, выявляемые при световой микроскопии (увеличение индекса мезангиальной экспансии, артериологиалиноз, тубулоинтерстициальный фиброз), а на 16 нед., по результатам электронной микроскопии, зафиксировано значимое утолщение гломерулярной базальной мембраны [19]. Внутрибрюшинное ведение никотинамида в дозе 230 мг/кг за 15 мин. до инъекции СТЗ (65 мг/кг) минимизирует повреждающее действие цитотоксина как на бета-клетки поджелудочной железы, вызывая лишь частичную инсулинопению и стабилизацию других клинических проявлений СД [26] за счёт способности никотинамида ингибировать вышеупомянутый фермент PARP [38].
Стоит отметить, что модель стрептозотоцин-индуцированного СД 2 типа с предварительным введением никотинамида ранее успешно была применена на практике зарубежными исследователями [26] и нашими соотечественниками [11], однако, без высокожирового питания и нефрэктомии специфических лабораторно-морфологических признаков ДН у крыс в этих работах не выявлено.
Преимуществами данной модели ДН у крыс по сравнению с генетическими моделями являются широкая доступность, низкая затратность, а также относительно простая методика воспроизведения. По нашим наблюдениям, такие животные развивают ожирение, среднюю по выраженности гипергликемию, инсулинорезистентность, альбуминурию, дислипидемию и умеренную артериальную гипертензию, являющиеся основными компонентами патогенеза ДН при СД 2 типа [12].
Несмотря на большое разнообразие описанных на сегодняшний день моделей сахарного диабета у экспериментальных животных, негенетические модели стрептозотоцинового сахарного диабета по-прежнему остаются наиболее доступными, относительно легко реализуемыми и достаточно валидными, адекватно воспроизводящими обратимые стадии диабетической болезни почек у людей, когда воздействие фармакологических препаратов с нефропротективными свойствами может замедлить прогрессирование течения осложнения. Ряд имеющихся недостатков таких моделей (возможность разброса экспериментальных данных по уровню гликемии, потенциальная нефротоксичность стрептозотоцина, возможность спонтанной нормализации инсулин-секреторной функции) могут быть устранены путём правильного подбора диабетогенной дозы препарата, заблаговременного планирования протокола эксперимента и времени определения маркеров почечной дисфункции, а также посредством предварительного введения химических соединений, уменьшающих повреждающее действие цитотоксина на инсулин-секретирующие клетки (никотинамид). Кроме того, при использовании определённых схем введения стрептозотоцина у крыс с индуцированным алиментарным ожирением возможно моделирование умеренной гипергликемии, инсулинорезистентности и дислипидемии, т.е. ключевых патогенетических компонентов сахарного диабета 2 типа, а хирургическая редукция массы функционирующей почечной паренхимы может способствовать ускорению манифестации гипертензии и лабораторно-морфологических признаков диабетической нефропатии.
Работа выполнена в сотрудничестве с ресурсным центром «Развитие молекулярных и клеточных технологий» СПбГУ.
Митрейкин В.Ф., д.м.н., профессор кафедры патологической физиологии с курсом клинической патофизиологии ПСПбГМУ им. акад. И.П. Павлова, г. Санкт-Петербург;
Гринева Е.Н., д.м.н., профессор, директор Института эндокринологии ФГБУ «СЗФМИЦ», г. Санкт-Петербург.
Владельцы патента RU 2400822:
Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной эндокринологии, и может быть использовано для моделирования сахарного диабета I типа у крыс. Для этого выбирают в качестве экспериментального животного крысу породы Wistar, генетически не предрасположенной к развитию аутоиммунных заболеваний. Экспериментальному животному вводят трехкратно стрептозотоцин с интервалом в 7 суток. При этом во время первого введения количество вводимого препарата определяют из расчета 25 мг/кг массы тела экспериментального животного. Во время второго введения количество вводимого препарата определяют из расчета 20 мг/кг массы тела экспериментального животного. Во время третьего введения количество вводимого препарата определяют из расчета 25 мг/кг массы тела экспериментального животного. Причем каждое введение стрептозотоцина осуществляют животному после 12 часов голодания. При этом за сутки перед каждым введением стрептозотоцина животному внутрибрюшинно вводят 1 мл неполного адъюванта Фрейнда. Способ обеспечивает адекватное воспроизведение модели. 2 ил.
Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной патофизиологии и эндокринологии.
Известно, что сахарный диабет (СД) I типа относится к аутоиммунным заболеваниям. Широкая распространенность этого заболевания и отсутствие точных корреляций с генетическими отклонениями в организме позволяют предполагать, что СД I типа заболевают и люди, генетически не предрасположенные к данному заболеванию. Так показано, что 85-90% случаев СД I типа наблюдается в семьях без первичной истории СД I типа среди родственников 1-й линии родства [Dahlquist G. et al., 1985]. В области экспериментальной медицины, однако, отсутствует адекватная аутоиммунная модель СД I типа у животных, генетически не предрасположенных к развитию данного заболевания.
На сегодняшний день широкое распространение получили аутоиммунные модели СД I типа у генетически предрасположенных животных: у крыс линии ВВ (BioBreeding), у мышей линии NOD (Non-Obese Diabetic). У данных линий животных имеет место предрасположенность к мутациям генов HLA (Human Leucocyte Antigens), при этом инсулиновая недостаточность развивается спонтанно и становится отчетливо выраженной спустя 1-2 месяца [Green E.A., Flavell R.A., 1999; Toyoda H., Formby В., 1998]. К преимуществам исследований на данных линиях относятся возможность блокады отдельных цитокинов специфическими антисыворотками и изучение последующих изменений в развитии и течении заболевания [Rabinovitch А. et al., 1995; Brown G.R. et al., 1998].
Недостатком этих моделей является то, что они созданы у животных, генетически предрасположенных к СД I типа, что искажает развитие и реализацию компенсаторных механизмов и регенерацию островковой ткани поджелудочной железы (ПЖ) вследствие измененного реагирования адаптивных систем организма; в результате модель не позволяет изучить и подобрать адекватную терапию для данного заболевания у животных без генетических дефектов развития иммунной системы.
Данные модели являются аналогами заявляемой аутоиммунной модели СД I типа.
На генетически не предрасположенных животных в эксперименте используются модели химически индуцированного СД с помощью введения стрептозотоцина (STZ) (однократно в дозе 65 мг/кг) или аллоксана (однократно в дозе 80-100 мг/кг), которые, как полагают, избирательно повреждают β-клетки поджелудочной железы. Однако при использовании аллоксана в указанной дозе развивается также нейро- и нефротоксическое действие, а развивающийся СД характеризуется высокой частотой реверсии [Arai Т. et al., 1996; Babaya N. et al., 2005; Hosokawa M. et al., 2001].
При использовании STZ в указанной дозе наступает глубокое повреждение β-клеток ПЖ, которые становятся не способными к восстановлению своей функции; помимо этого STZ повреждает регионарные стволовые клетки ПЖ и костного мозга, что предотвращает индукцию процессов регенерации β-клеток и приводит к ингибированию иммунных реакций [Nir Т. et al., 2007]. В результате под влиянием стрептозотоцина прогрессирует фиброзирующая регенерация, которая не способствует развитию аутоиммунного повреждения.
Данная модель является прототипом заявляемой модели СД I типа.
Таким образом, на сегодняшний день адекватная аутоиммунная модель СД I типа на генетически не предрасположенных животных отсутствует.
Задачей заявляемого патента является создание аутоиммунной модели СД I типа у животных, генетически не предрасположенных к развитию СД I типа и других аутоиммунных заболеваний.
Техническим результатом является создание адекватной устойчивой аутоиммунной модели сахарного диабета I типа у генетически не предрасположенных к развитию аутоиммунных заболеваний животных, исключение при этом необратимого повреждения островковых клеток ПЖ, токсического воздействия на регионарные стволовые клетки и ингибирования регенераторных процессов в поджелудочной железе с сохранением возможности терапевтического регулирования повреждения ПЖ.
Сущность изобретения заключается в следующем. Выбирают в качестве экспериментального животного крысу породы Wistar, генетически не предрасположенную к развитию аутоиммунных заболеваний, и внутрибрюшинно вводят экспериментальному животному стрептозотоцин трехкратно с интервалом в 7 суток. При этом во время первого введения количество вводимого препарата определяют из расчета 25 мг/кг массы тела экспериментального животного. Во время второго введения количество вводимого препарата определяют из расчета 20 мг/кг массы тела экспериментального животного. Во время третьего введения количество вводимого препарата определяют из расчета 25 мг/кг массы тела экспериментального животного. Причем каждое введение стрептозотоцина осуществляют животному после 12 часов голодания. При этом за сутки перед каждым введением стрептозотоцина животному внутрибрюшинно вводят 1 мл неполного адъюванта Фрейнда.
Способ осуществляется следующим образом.
1. Подготовка к иммунизации животного. После профилактического осмотра животного с целью исключения различных заболеваний под эфирным наркозом обрабатывают поверхность передней брюшной стенки животного по Филончикову-Гроссиху.
2. Введение неполного адъюванта Фрейнда осуществляют внутрибрюшинно в объеме 1 мл в месте предварительно обработанной области. После внутрибрюшинного введения в течение 30 секунд место инъекции умеренно прижимают асептическим спиртовым шариком с целью исключения обратного тока жидкости, после чего обрабатывают раствором повидон-йод.
3. После 12 часов голодания животному осуществляют введение разведенного в 0,5 мл охлажденного цитратного буфера (рН=4,5) стрептозотоцина внутрибрюшинно в количестве 25 мг/кг массы тела экспериментального животного в месте предварительно обработанной области. Введение стрептозотоцина осуществляют через сутки после введения неполного адъюванта Фрейнда. После внутрибрюшинного введения в течение 30 секунд место инъекции умеренно прижимают асептическим спиртовым шариком с целью исключения обратного тока жидкости, после чего обрабатывают раствором повидон-йод.
4. Через 7 суток после первого введения неполного адъюванта Фрейнда осуществляют второе введение неполного адъюванта Фрейнда внутрибрюшинно в объеме 1 мл в месте предварительно обработанной области. После внутрибрюшинного введения в течение 30 секунд место инъекции умеренно прижимают асептическим спиртовым шариком с целью исключения обратного тока жидкости, после чего обрабатывают раствором повидон-йод.
5. После 12 часов голодания животному осуществляют второе введение разведенного в 0,5 мл охлажденного цитратного буфера (рН=4,5) стрептозотоцина внутрибрюшинно в количестве 20 мг/кг массы тела экспериментального животного в месте предварительно обработанной области. Введение стрептозотоцина осуществляют через сутки после второго введения неполного адъюванта Фрейнда. Таким образом, интервал между первым и вторым введениями стрептозотоцина составляет 7 суток. После внутрибрюшинного введения в течение 30 секунд место инъекции умеренно прижимают асептическим спиртовым шариком с целью исключения обратного тока жидкости, после чего обрабатывают раствором повидон-йод.
6. Через 7 суток после второго введения неполного адъюванта Фрейнда осуществляют третье введение неполного адъюванта Фрейнда внутрибрюшинно в объеме 1 мл в месте предварительно обработанной области. После внутрибрюшинного введения в течение 30 секунд место инъекции умеренно прижимают асептическим спиртовым шариком с целью исключения обратного тока жидкости, после чего обрабатывают раствором повидон-йод.
7. После 12 часов голодания животному осуществляют третье введение разведенного в 0,5 мл охлажденного цитратного буфера (рН=4,5) стрептозотоцина внутрибрюшинно в количестве 25 мг/кг массы тела экспериментального животного в месте предварительно обработанной области. Введение стрептозотоцина осуществляют через сутки после третьего введения неполного адъюванта Фрейнда. Таким образом, интервал между вторым и третьим введениями стрептозотоцина составляет 7 суток. После внутрибрюшинного введения в течение 30 секунд место инъекции умеренно прижимают асептическим спиртовым шариком с целью исключения обратного тока жидкости, после чего обрабатывают раствором повидон-йод.
Предлагаемая методика моделирования была использована на 30 крысах породы Wistar, не предрасположенных к развитию аутоиммунных заболеваний, контрольную группу составили 15 животных той же породы.
Уровень глюкозы у животных в группе с моделированием СД I типа начинал подниматься через 5-7 суток после последнего введения стрептозотоцина и к концу 3-4 недели достигал 17-20 ммоль/л (норма 4-6 ммоль/л), затем отмечалось дальнейшее увеличение уровня глюкозы, достоверно сохраняющееся в течение 3 месяцев, тогда как в контрольной группе уровень глюкозы не повышался и сохранялся в пределах нормы на всем сроке наблюдения.
На фиг.1 представлена динамика содержания глюкозы в крови у животных; линия с ромбами — после моделирования СД I типа; линия с квадратами — контроль. Данные показатели свидетельствуют о развитии устойчивого СД.
При гистологическом исследовании островковой ткани ПЖ животных из группы с моделированием СД I типа имелись признаки прогрессирования аутоиммунного повреждения островковой ткани ПЖ. Так, через месяц было отмечено наличие характерной выраженной лимфоцитарной инфильтрации островков Лангерганса (ОЛ) — инсулита, а через три месяца ОЛ уже не имели четких контуров, а ткань их характеризовалась признаками дистрофии и фиброза.
На фиг.2 представлено морфологическое состояние островковой ткани поджелудочной железы у животных при моделировании СД I типа. Окраска: гематоксилин и эозин. Увеличение ×200; А — через 1 месяц после моделирования; Б — через 3 месяца после моделирования. Данная морфологическая картина свидетельствует о специфическом аутоиммунном повреждении островковой ткани ПЖ.
Для доказательства аутоиммунной природы СД при моделировании у генетически не предрасположенных животных по предлагаемому способу на 40-е сутки эксперимента был выполнен адаптивный перенос заболевания путем введения интактным животным спленоцитов (лимфоцитов селезенки), полученных от животных с аутоиммунной моделью СД I типа. В результате у животных, которым был выполнен адаптивный перенос спленоцитов, через 2-3 недели было отмечено возрастание уровня глюкозы в крови и последующее развитие клиники сахарного диабета. Осуществление адаптивного переноса с помощью лимфоцитов свидетельствует о специфическом аутоиммунном характере заболевания.
Таким образом, эмпирически подобранное сочетанное использование стрептозотоцина и неполного адъюванта Фрейнда в определенном установленном нами взаимосвязанном режиме позволяет получить адекватную устойчивую аутоиммунную модель сахарного диабета I типа у генетически не предрасположенных к развитию аутоиммунных заболеваний животных, что коррелирует с широкой распространенностью этого заболевания.
Способ моделирования сахарного диабета I типа у крыс, включающий выбор в качестве экспериментального животного крысы породы Wistar, генетически не предрасположенной к развитию аутоиммунных заболеваний, и внутрибрюшинное введение стрептозотоцина, отличающийся тем, что экспериментальному животному стрептозотоцин вводят трехкратно с интервалом в 7 суток, при этом во время первого введения количество вводимого препарата определяют из расчета 25 мг/кг массы тела экспериментального животного; во время второго введения количество вводимого препарата определяют из расчета 20 мг/кг массы тела экспериментального животного; во время третьего введения количество вводимого препарата определяют из расчета 25 мг/кг массы тела экспериментального животного; причем каждое введение стрептозотоцина осуществляют животному после 12 ч голодания; при этом за сутки перед каждым введением стрептозотоцина животному внутрибрюшинно вводят 1 мл неполного адъюванта Фрейнда.
канд. мед. наук, руководитель экспериментальной лаборатории биомедицинских технологий ФГБУ «Сибирский федеральный научно-клинический центр Федерального медико-биологического агентства»,
д-р мед. наук, ведущий научный сотрудник экспериментальной лаборатории биомедицинских технологий ФГБУ «Сибирский федеральный научно-клинический центр Федерального медико-биологического агентства»,
канд. биол. наук, научный сотрудник экспериментальной лаборатории биомедицинских технологий ФГБУ «Сибирский федеральный научно-клинический центр Федерального медико-биологического агентства»,
д-р мед. наук, заместитель генерального директора по научно-клинической работе ФГБУ «Сибирский федеральный научно-клинический центр Федерального медико-биологического агентства»,
канд. мед. наук, генеральный директор ФГБУ «Сибирский федеральный научно-клинический центр Федерального медико-биологического агентства»,
METHODOLOGICAL ASPECTS OF MODELING OF DIABETES IN THE EXPERIMENT
Constantin Zaitsev
Ph.D. in Medical Science, Head of Experimental Laboratory of Biomedical Technologies of Siberian Federal Science-clinical Center of Federal medicobiological agency,
Oksana Zhukova
Ph.D. in Medical Science, Leading researcher of Experimental Laboratory of Biomedical Technologies of Siberian Federal Science-clinical Center of Federal medicobiological agency,
Alena Gostyukhina
Ph.D. in Biological Science, researcher of Experimental Laboratory of Biomedical Technologies of Siberian Federal Science-clinical Center of Federal medicobiological agency,
Natal’ya Abdulkina
Ph.D. in Medical Science, Deputy general director for research and clinical work of Siberian Federal Science-clinical Center of Federal medicobiological agency,
Victor Vorob’ev
Ph.D. in Medical Science, General director of Siberian Federal Science-clinical Center of Federal medicobiological agency,
Russia, Tomsk region, Seversk
Исследование было посвящено определению оптимальной дозы аллоксана для моделирования состояния сахарного диабета у крыс. Три группы животных по 10 особей в каждой получали раствор моногридрата аллоксана в различных концентрациях. Контролем служила группа из 10 крыс, которым вводили физиологический раствор в эквивалентном объеме. У всех животных проводили динамическую оценку содержания глюкозы крови в течение 14 суток эксперимента. Установлено, что у крыс при введении 12 мг/100 г аллоксана уровень глюкозы не превышал референсных границ нормального значения, 17 мг/100 г – повышенная концентрация глюкозы во все сроки эксперимента, 22 мг/100 г веса – летальная доза аллоксана. Таким образом, для моделирования сахарного диабета адекватной дозой аллоксана является 17 мг/100 г веса крысы.
The study has been devoted to determination of the optimal dose of alloxan to model diabetic state in rats. Three groups of animals each of them consists of 10 ones received solution of monohydrate alloxan in different concentrations. The control has been presented by the group of 10 rats, which obtained saline solution injection in equivalent volume. Dynamic assessment of blood glucose level was performed for all animals during 14 days of the experiment. It has been found that injection of 12 mg of alloxan/100 g of weight in rats has not caused exceeding of glucose level over reference limits of the normal value, one of 17 mg/100 g of weight has increased glucose concentration at all times of the experiment, and one of 22 mg/100 g of weight was lethal dose of alloxan. Thus, the dose of 17 mg alloxan/100 g of rat weight is adequate to simulate diabetes.
Ключевые слова: биологическое моделирование; сахарный диабет; аллоксан.
Keywords: biological modeling; diabetes mellitus; alloxan.
Биологическое моделирование является необходимым «инструментарием» для экспериментальной медицины. На сегодняшний день выявление закономерностей и особенностей развития патологических процессов, формирования их осложнений, разработка способов лечения и профилактики заболеваний, изучение механизмов действия лекарственных средств с целью направленного их применения было бы крайне затруднительно без моделирования соответствующих патологических состояний у экспериментальных животных.
Высокая социальная значимость сахарного диабета обусловливает актуальность данной проблемы для медико-биологической науки [3, 5]. К настоящему времени разработано несколько способов моделирования сахарного диабета в эксперименте: хирургический (полное или частичное удаление поджелудочной железы), химический (введение химических веществ, избирательно воздействующих на β-клетки островков Лангерганса), эндокринный (введение аденогипофизарного, соматотропного и адренокортикотропного гормонов), иммунологический (введение антител против инсулина) и генетический (использование чистых линий животных с наследственно обусловленной формой патологии) [1, 2].
Наиболее удобным способом в современных условиях экспериментальной диабетологии считается моделирование сахарного диабета с помощью панкреотоксинов: аллоксан, стрептозотоцин, дитизон и другие [6]). При этом необходимо учитывать, что эффективная доза препарата зависит от вида животного, способа введения, состояния питания и прочих условий [7].
Целью настоящей работы явилось определение оптимальной дозы аллоксана для моделирования состояния сахарного диабета у крыс.
Материал и методы
Исследования проводили в утренние часы для исключения влияния на результаты суточных колебаний функциональных параметров [4]. Сахарный диабет I типа моделировали у 30 крыс-самцов линии Wistar с помощью однократного введения раствора моногидрата аллоксана («Sigma», США). Для определения оптимальной дозы аллоксана в эксперименте использовали три различные его концентрации: 12, 17 и 22 мг на 100 г животного. Инъекции вводили внутрибрюшинно, так как данный способ введения отличается малой травматичностью для животных. При моделировании учитывали, что диабетогенное действие аллоксана более активно проявляется у животных, находящихся на предварительно голодной диете [8], поэтому все экспериментальные крысы в течение 24 ч до начала моделирования не получали пищу, но при этом доступ к воде для них оставался неограниченным. Контролем служила группа из 10 крыс, которым аналогично вводили физиологический раствор в эквивалентном объеме. До начала эксперимента, а также на 1-е, 3-е, 7-е и 14-е сутки после введения аллоксана у всех животных с помощью глюкометра «Accu-Chek Performa Nano» («Roche Diagnostics», Германия) определяли уровень глюкозы в капиллярной крови, полученной путем разреза десны. При обработке полученных данных были использованы методы статистического описания, включающие проверку на нормальность распределения исследуемого признака по критерию Шапиро-Вилка, расчет среднего (М), ошибки среднего (m), сравнение показателей с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни.
Результаты исследования
Полученные результаты показали, что у контрольных животных изучаемый показатель во все сроки эксперимента был на уровне 5,40–5,76 ммоль/л. До введения аллоксана уровень глюкозы в крови у всех животных соответствовал норме. У животных первой опытной группы, получивших 12 мг/100 г веса тела аллоксана, во все сроки эксперимента концентрация глюкозы колебалась от 4,28 до 6,26 ммоль/л. При использовании аллоксана в дозе 17 мг/100 г веса крысы в 1-е сутки уровень глюкозы увеличился в 2 раза, максимальное значение было достигнуто на 7-е сутки (22 ммоль/л), в конце эксперимента отмечено снижение до 13,3 ммоль/л. Доза аллоксана 22 мг/100 г вызвала резкий подъем концентрации глюкозы в первые сутки и гибель всех животных данной группы в течение недели (рисунок 1).
Рисунок 1. Динамика содержания глюкозы крови у крыс при моделировании аллоксан-индуцированного сахарного диабета
Известно, что аллоксан вызывает избирательное повреждение проницаемости плазмолеммы β-клеток поджелудочной железы, которые вырабатывают инсулин, вследствие его реакции с дитиоловыми группами, необходимыми для поддержания целостности мембран [8]. Β-клетки поджелудочной железы разрушаются от действия аллоксана, инсулин не вырабатывается и формируется сахарный диабет [2]. Этим объясняется резкое повышение глюкозы в крови крыс на все исследуемые сутки эксперимента.
Установлено, что у крыс при введении 12 мг/100 г аллоксана уровень глюкозы не превышал референсных границ нормального значения, 17 мг/100 г – повышенная концентрация глюкозы во все сроки эксперимента, 22 мг/100 г веса – летальная доза аллоксана. Таким образом, для моделирования сахарного диабета адекватной дозой аллоксана является 17 мг/100 г веса крысы.