Глюкозооксидазный метод содержания глюкозы в сыворотке крови

Принцип метода.Глюкоза в присутствии фермента глюкозооксидазы окисляется кислородом воздуха с образованием пероксида водорода, при разрушении которого под влиянием пероксидазы происходит конденсация фенола и p-аминоантипирина в окрашенное соединение. Реакция протекает по схеме:

2Н₂О₂ + фенол + 4-аминоантипирин -¾¾® 4(n-бензохинонмоно- + 4Н₂О.

(п-аминофеназон) пероксидаза имино)-феназон

Интенсивность окраски раствора пропорциональна концентрации глюкозы в крови.

Ход работы:1. В пробирки внести реактивы в соответствии с указанными объемами:

Отмерить, мл	Опытная проба	Стандартная проба	Контрольная проба
Сыворотка крови	0,02	—	—
Стандартный раствор глюкозы	—	0,02	—
Дистиллированная вода	—	—	0,02
Реактив для определения глюкозы	3,0	3,0	3,0

Пробы перемешивают и инкубируют 30 мин. в термостате при 37 0 С. Измеряют оптическую плотность опытной (Е₁) и стандартной пробы (Е₂) против контрольной в кювете 0,5 см, при длине волны 480-520 нм. Измерение должно быть проведено до истечения 5 минут.

Содержание глюкозы определяют путем расчета по формуле:

Сопоставить с нормой содержания у здоровых людей и сделать вывод.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Лучшие изречения: Только сон приблежает студента к концу лекции. А чужой храп его отдаляет. 8582 — | 7403 — или читать все.

87.119.242.255 © studopedia.ru Не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования. Есть нарушение авторского права? Напишите нам | Обратная связь.

Отключите adBlock!
и обновите страницу (F5)
очень нужно

источник

Для определения концентрации исключительно глюкозы в различных жидкостях организма человека используют глюкозооксидазный метод. Преимуществом этого теста является его точность. Диагностика в отличие от экспресс-методов позволяет выявить количество чистой глюкозы, без домеси к ней фруктозы и других сахаров. Принцип этой реакции заключается в окрашивании раствора, которое происходит вследствие взаимодействия окислителей со специфическими красителями. Оценка результатов исследования проводится с помощью метода колориметрии и сравнения со стандартными растворами.

ВАЖНО ЗНАТЬ! Даже «запущенный» диабет можно вылечить дома, без операций и больниц. Просто прочитайте что говорит Марина Владимировна читать рекомендацию.

Этот тест используют для выявления нарушения толерантности к сахару и развития преддиабета, а также в стадии разгара болезни. Но для таких целей анализ используют редко, это связано с его высокой стоимостью и длительным ожиданием результата. Чаще всего определение глюкозы в крови и моче с помощью этого метода применяют при дифференциальной диагностике таких заболеваний, как:

Сахар снижается мгновенно! Диабет со временем может привести к целому букету заболеваний, таких как проблемы со зрением, состоянием кожи и волос, появлению язв, гангрены и даже раковых опухолей! Люди, наученные горьким опытом для нормализации уровня сахара пользуются. читать далее.

синдром непереносимости лактозы;
непереносимость фруктозы;
выделение фруктозы с биологическими жидкостями организма;
повышенная концентрация пентозы в моче.

Несомненным достоинством глюкозооксидазного теста является его точность.

Существуют различные методы определения концентрации глюкозы в крови, но глюкозооксидазный является наиболее точным. Подоснова его состоит в том, что при взаимодействии сахара с кислородом воздуха происходит окисление реагента. В раствор выделяется перекись водорода. Это вещество взаимодействует с ортотолуидином, образуя окрашенное соединение. Для поведения этой реакции необходимо присутствие специальных ферментов. При реакции окисления должна присутствовать глюкозооксидаза, а при окрашивании жидкости — пероксидаза. Интенсивность окраски раствора будет зависеть от содержания глюкозы и быть более всего интенсивной при высоком ее содержании.

Оценка результата происходит с помощью количественного метода фотометрии через один и тот же промежуток времени. Обязательно использование калибровочного раствора, который содержит определенную заявленную норму сахара и, отталкиваясь от нее, можно судить о концентрации глюкозы в выделяемых жидкостях организма, чаще в крови.

Забор материала от больного осуществляется натощак. Для проведения теста используют венозную кровь в количестве 5 мл. Накануне диагностики больному показана строгая диета. Это позволит судить о достоверности результата и исключить возможные погрешности анализа. За 2 дня перед изъятием крови пациент должен отказаться от вредных привычек употребления алкоголя и курения. Также необходимо ограничить прием чрезмерно сладких блюд и по возможности избегать стрессовых ситуаций.

Для получения плазмы с сахаром проводится центрифугирование крови.

Чаще всего этот метод определения концентрации глюкозы выполняют способом центрифугирования, которым выделяют форменные элементы. Количество сахара определяют уже в плазме. При добавлении к ней всех необходимых реагентов окраска наблюдается через 20 минут, если тест проводится при комнатной температуре. Расчет уровня глюкозы проводится по калибровочному графику или с помощью правила порций.

Для определения сахара наиболее удобно использовать экспресс-методы определения глюкозы в крови. Это объясняется простотой в использовании и быстрым получением результата. Кроме этого, больному не нужно идти в лабораторию или больницу. Но в отличие от глюкозооксидазного теста такая диагностика является недостоверной. Так как не дифференцирует глюкозу от других сахаров и определяет их концентрацию вместе.

Основу глюкозооксидазной реакции составляет натрия хлорид 9% раствор и цинка сульфат 50%. Их добавляют на стадии центрифугирования крови. Кроме этого, используют буферный раствор с уксусной кислотой и ацетатом натрия. Методом титрования определяют его рН на уровне 4,8. После, добавляется глюкозооксидаза, из-за чего выделяется перекись водорода и пероксидаза, участвующая в окрашивании раствора до нужной концентрации для получения точного результата.

Измерение количества сахара происходит в специальных единицах — миллимолях на литр раствора.

Глюкозооксидазное исследование крови проходят обязательно на пустой желудок и используют для этого плазму или сыворотку. Норма количества ее для взрослых как для женщин, так и для мужчин составляет 3,3—5,5. Для детей до 15-ти лет этот показатель немного ниже и колеблется в пределах 3,2—5,3. У новорожденных глюкоза крови составляет 1,7—4,2. Увеличение показателей наблюдается при развитии у больного сахарного диабета или при нарушении толерантности к глюкозе. Это состояние является преддиабетом, и если его вовремя не лечить, то в скором времени оно приведет к развитию этой тяжелой патологии.

Судя по тому, что вы сейчас читаете эти строки — победа в борьбе с высоким уровнем сахара в крови пока не на вашей стороне.

И вы уже думали о стационарном лечении? Оно и понятно, ведь диабет — очень опасное заболевание, которое при несвоевременном лечении может закончиться летальным исходом. Постоянная жажда, учащенное мочеиспускание, нечёткость зрения. Все эти симптомы знакомы вам не понаслышке.

Но возможно правильнее лечить не следствие, а причину? Рекомендуем прочитать статью о современных методах лечения диабета. Читать статью >>

источник

закрепить знания о превращениях глюкозы в организме;

изучить клинико-диагностическое значение глюкозы;

научиться исследовать уровень глюкозы в крови ферментативным методом.

Задания для самостоятельной работы:

Перепишите в тетрадь принцип и методику проведения практической работы.

Оборудуйте рабочее место для практической работы.

Выполните практическую работу.

Сделайте необходимые расчеты.

Заполните бланк анализа. Оцените полученные результаты.

Сделайте вывод по работе и рисунки.

Ответьте на дополнительные вопросы.

Определение глюкозы основано на реакции, катализируемой глюкозооксидазой:

Глюкоза +O2 глюкозооксидаза глюколактон + Н2О2

Образующаяся в ходе данной реакции перекись водорода вызывает окисление субстратов пероксидазы с образованием окрашенного продукта. Увеличение оптической плотности раствора пропорционально концентрации глюкозы в образце.

4. Калибровочный раствор глюкозы

Проведите исследование количества глюкозы в сыворотке крови согласно таблице.

Реакционную смесь перемешайте и инкубируйте при 37С не менее 15 минут.

Через 5 минут после начала инкубации пробирки интенсивно встряхните.

После инкубации измерьте оптическую плотность опытной и стандартной проб относительно контроля в кювете на 5 мм при 500 нм.

Расчет концентрации глюкозы производят по формуле:

Сглюкоза= Еоп/Ест * 10 (ммоль/л)

Норма глюкозы в цельной крови: 3,3 – 5,5 ммоль/л.

Норма глюкозы в сыворотке крови: 3,7 – 6,1 ммоль/л.

Сразу после рождения уровень глюкозы в крови детей соответствует её содержанию в плазме крови матери. Однако уже в первые часы жизни концентрация глюкозы в крови падает, достигая на вторые сутки 2,5 ммоль/л; к 5-6 суткам концентрация глюкозы крови увеличивается. Постепенное её возрастание происходит и в дальнейшем, но лишь к 15 годам концентрация глюкозы достигает значений, характерных для взрослого человека.

Гипергликемия — увеличение уровня глюкозы в крови, может быть:

Инсулярная – причиной может быть поражение паренхимы поджелудочной железы или гипофункция бетта-клеток островков Лангерганса, при которых снижается уровень выработки инсулина.

Экстраинсулярная – не связана с выработкой инсулина, подразделяется на:

Физиологическую – причина прием углеводной пищи (алиментарная) или различные эмоциональные состояния, при которых возрастает уровень адреналина (нейрогенная).

Патологическая – причинами могут быть заболевания желез внутренней секреции (опухоли передней доли гипофиза, надпочечников, тиреотоксикоз и т.д.), токсикозы различного происхождения, травмы, опухоли мозга, снижение обмена глюкозы при наркозе, воспалениях, септических состояниях, вследствие нарушения функций ферментативных систем.

Гипергликемиявстречается при следующих заболеваниях:

Сахарный диабет, поражениях ЦНС, печени, желез внутренней секреции, стрессовых ситуациях, обильном приеме углеводной пищи, приеме некоторых лекарственных средств (кофеин, стрихнин, адреналин, эфир, опий, морфий, хлороформ и т.д.).

Гипогликемия — уменьшение уровня глюкозы в крови, встречается при:

Снижении гормональной функции щитовидной железы, надпочечников, гипофиза.

Увеличение функций инсулярного аппарата поджелудочной железы.

Некоторые формы поражения почек (нефриты, нефрозы).

Некоторые формы поражения печени (гепатиты, жировая инфильтрация печени).

Некоторые формы поражения тонкого кишечника, удаление значительной части желудка.

Какие методы определения глюкозы в крови вы знаете?

Почему основным показателем обмена углеводов является глюкоза?

Для диагностики каких патологий назначается анализ глюкозы в крови?

Каково нормальное содержание глюкозы в артериальной и венозной крови, сыворотке и моче?

*Какой из известных методов определения глюкозы является наиболее специфичным? Почему вы так считаете?

*Отличается ли содержание глюкозы в крови у детей и взрослых? Почему?

*Спортсмен пробежал 100-метровую дистанцию. Измениться ли содержание молочной кислоты у него в крови? Почему?

источник

Принцип метода. Метод основан на специфичности действия фермента глюкозооксидазы. Этот фермент окисляет глюкозу в присутствии молекулярного кислорода с образованием глюконолактона, спонтанно гидролизирующегося до глюконовой кислоты. Глюкозооксидаза окисляет глюкозу с образованием пероксида водорода (Н₂О₂), который под действием пероксидазы реагирует с 4-аминоантипирином и фенолом. В результате образуется окрашенное в розовый цвет соединение, оптическая плотность которого при 510 нм пропорциональна концентрации глюкозы в образце.

глюкоза +О₂ +Н₂О → глюконовая кислота + Н₂О₂

2 Н₂О₂ + 4-аминоантипирин + фенол → хинонимин + 4Н₂О

Оборудование: КФК, центрифуга, термостат, штативы, пробирки, пипетки, биологический материал, реактивы содержащиеся в рабочем растворе.

Калибровочный раствор глюкозы (эталон)

Пробирки инкубируют в термостате при 37 о С 15 минут, затем колориметрируют на КФК при зелёном светофильтре в кюветах с толщиной слоя 5 мм против холостой пробы (Н₂О). Розовая окраска устойчива в течение 1 часа после инкубации.

Расчет содержания глюкозы производят по формуле:

С=х С стандарт, где

С – содержание глюкозы в опытной пробе, моль/л;

Еоп – оптическая плотность пробы;

Ест – оптическая плотность калибровочной пробы;

С стандарт – содержание в калибровочном растворе, моль/л.

Нормальные величины:  новорожденные – 2,8-4,4 ммоль/л

Гипогликемия (ГГК). Повышение уровня глюкозы в крови обусловлено множеством причин, в соответствии с которыми различают две группы гипергликемии.

1. Инсулярные – связанные с недостаточным содержанием в организме инсулина или обусловленные неэффективностью его действия.

2. Экстраинсулярные (внеинсулярные) – не зависят от влияния инсулина.

Наиболее существенное значение в формировании ГГК имеют следующие процессы: усиленный распад гликогена; повышенный неоглюкогенез; торможение синтеза гликогена; снижение утилизации глюкозы тканями под влиянием гормональных антагонистов инсулина: соматотропина, глюкортикоидов, тироксина, тиреотропина.

Алиментарные гипергликемии отмечают при избыточном поступлении глюкозы в кровь (например, гипергликемия при сахарной нагрузке). «Печеночные» гипергликемии встречаются при диффузных поражениях печени.

Стойкая и выраженная гипергликемия чаще всего сопровождает сахарный диабет. Принято выделять инсулинзависимый сахарный диабет и инсулиннезависимый сахарный диабет, или, соответственно, сахарный диабет I типа и сахарный диабет II типа. Формирование сахарного диабета I типа связано, прежде всего, с нарушениями синтеза и обмена инсулина.

Вторая группа гипергликемий связана, прежде всего, с гиперфункцией эндокринных желез, продуцирующих гормоны – антагонисты инсулина. Она наблюдается при таких заболеваниях, как синдром и болезнь Иценко-Кушинга, акромегалия, тиреотоксикоз, феохромоцитома, глюкоганома. Уровень глюкозы в крови повышается и при некоторых заболеваниях печени (в частности, у 10-30% больных циррозом печени), гемохроматозе (пигментном циррозе печени, бронзовом диабете).

Гипогликемия (ГПГ) — снижение содержания глюкозы в крови – чаще всего связана с абсолютным или относительным повышением уровня инсулина в крови. Внепанкреатическая гипогликемия отмечается в результате нарушения баланса между выраженностью процессов гликогенолиза и гликонеогенеза в печени при острых и хронических гепатитах, циррозах, острой и подострой дистрофии печени, алкогольной интоксикации, отравлениях мышьяком, фосфором, при длительной механической желтухе, застойной печени, первичном или метастатическом раке печени. Снижение концентрации глюкозы в крови часто наблюдается у больных, страдающих раком пищевода и другими злокачественными опухолями внепанкреатической локализации (фиброма, фибросаркома, нейрома), а также при неукротимой рвоте, анорексии, печеночном диабете, уремии, обильной лактации и глюкозурии у беременных.

Гипогликемия может быть центрального происхождения вследствие перенесенных психических травм, энцефалита, субарахноидального кровоизлияния, опухоли мозга.

1. Наследственные нарушения переваривания углеводов.

2. Какие виды гиперглюкоземии вам известны?

3. Каковы причины патологической гиперглюкоземии?

4. В чем причина возникновения инсулинзависимого сахарного диабета?

5. Каковы биохимические причины возникновения наследственных заболеваний: а)гликогенозов? б)агликогенозов? в)фруктоземии? г)галактоземии?

6. Каковы биохимические изменения углеводного обмена при голодании?

7. Принцип метода определения толерантности к глюкозе.

источник

Определение концентрации глюкозы в крови – одно из наиболее часто выполняемых биохимических исследований в лабораториях.

Глюкозооксидазный метод определения глюкозы в крови и моче основан на реакции окисления глюкозы в присутствии фермента глюкозооксидазы с образованием перекиси водорода, которая в свою очередь в присутствии пероксидазы окисляет ортотолуидин с образованием окрашенных продуктов; о концентрации глюкозы судят по количеству окрашенных продуктов.

Поскольку глюкозооксидазный метод направлен на выявление именно глюкозы, а не всех видов сахаров, его применяют в дифференциальной диагностике следующих заболеваний:

Глюкоза в присутствии фермента глюкозооксидазы окисляется кислородом воздуха с образованием в ходе реакции перекиси водорода. Перекись водорода в присутствии фермента пероксидазы окисляет ортотолуидин с образованием окрашенного соединения, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию глюкозы.

Глюкозооксидазный метод позволяет определить уровень глюкозы в плазме крови, сыворотке и спинномозговой жидкости.

новорожденные — 1,7 — 4,2
дети от 6 недель до 15 лет — 3,3 — 5,4
взрослые (мужчины, женщины) — 3,8 — 5,5

— в сыворотке крови, натщесерце

новорожденные — 2,6 — 4,2
дети от 6 недель до 2 лет — 3,3 — 5,4
взрослые (мужчины, женщины) — 3,8 — 5,5

1. Натрия хлорида 9 грамм/литр(изотонический раствор): готовят, растворяя 0,9 г NaCl в 100 мл воды.

2. Цинка сульфат, 50 г/л: 5 г сульфата цинка (ZnSO4) растворяют в воде, объем доводят до 100 мл.

3. Натр едкий, 0,3 моль/л: готовят, растворяя 1,2 г NaOH в 100 мл воды, концентрацию проверяют титрованием (она должна быть 0,3 н).

4. Ортотолуидин, 1%-ный раствор: 1 г препарата растворяют в 100 мл абсолютного спирта. Раствор можно хранить в холодильнике в склянке с притертой пробкой несколько месяцев. Имеющийся в продаже препарат можно очистить перекристаллизацией, для чего его растворяют в абсолютном спирте, добавляют воду и выпавшие кристаллы отсасывают на фильтре, затем сушат над хлоридом кальция.

5. Ацетатный буферный раствор рН 4,8: смешивают 4 части 0,25 н уксусной кислоты (проверить титрованием) и 6 частей 0,25 н ацетата натрия (содержит 34 г CH3COONa X ЗН2О в 1 литре).

6. Глюкозооксидаза — сухой препарат активностью 3000 ед/мг или больше.

7. Пероксидаза из хрена. 1 мг растворяют в 5 мл ацетатного буфера, в холодильнике можно хранить несколько дней.

8. Рабочий реактив: в 80 мл ацетатного буфера растворяют 2 мг глюкозооксидазы и 1 мг пероксидазы, прибавляют 1 мл 1%-ного раствора ортотолуидина, перемешивают и доводят объем буферным раствором до 100 мл. Рабочий реактив должен быть прозрачным, бесцветным или иметь слабо-зеленый оттенок, в этом случае он устойчив при хранении на холоде. Если же окраска интенсивна или через несколько часов после приготовления начинает выпадать осадок, это значит, что ортотолуидин недостаточно чистый и его надо перекристаллизовать.

9. Калибровочные растворы глюкозы. Глюкозу предварительно высушивают при температуре 37°С и хранят в эксикаторе. Сначала готовят основной раствор с концентрацией 50 ммоль/л, для чего 180 мг вещества растворяют в 20 мл насыщенного раствора (примерно 0,3%-ного) бензойной кислоты. Из этого раствора готовят рабочие калибровочные растворы, содержащие 3; 6; 9; 12; 15; 18 и 21 ммоль/л, для чего берут 0,6; 1,2; 1,8; 2,4; 3; 3,6 и 4,2 мл основного раствора и доводят насыщенным раствором бензойной кислоты до объема 10 мл. Эти растворы содержат глюкозу в тех же концентрациях, в которых она бывает в крови, что облегчает расчеты при калибровке.

В центрифужные пробирки вносят 1,1 мл раствора хлорида натрия, 0,4 мл раствора сульфата цинка и 0,4 мл 0,3 н раствора NaOH, перемешивают; при этом образуется очень тонкий гель гидрата окиси цинка, в него выпускают 0,1 мл крови или калибровочного раствора, снова перемешивают и через 10 минут центрифугируют при скорости 3000 об./мин в течение 10 минут.

К 1 мл надосадочной жидкости добавляют 3 мл рабочего реактива и осторожно перемешивают.

Постепенно начинает развиваться окраска, которая при обычной комнатной температуре достигает максимума через 13-15 минут, а затем постепенно уменьшается. Фотометрируют всегда через один и тот же промежуток времени после добавления рабочего реактива в кюветах с длиной оптического пути 1 сантиметр с красным светофильтром (длина волны 625 нм) против холостого опыта, который ставят одновременно с рабочими пробами, но вместо крови берут физиологический раствор хлорида натрия.

При приготовлении калибровочного графика вместо проб крови берут 0,1 мл соответствующего калибровочного раствора.

Расчет уровня глюкозы можно проводить по правилу пропорций или по калибровочному графику, для построения которого на одной оси откладывают концентрацию глюкозы (ммоль/л), а на другой — величину экстинкции.

1. Можно сначала выпустить кровь из пипетки в изотонический раствор хлорида натрия, а затем добавить растворы сульфата цинка и NaOH.

2. При систематической работе нет необходимости постоянно строить калибровочный график по всем точкам, достаточно ежедневно обрабатывать холостую пробу и 2-3 точки в диапазоне 3-9 ммоль/л, а полный калибровочный график строить лишь при смене реактивов или налаживании методики.

источник

Принцип метода. Ферментативный метод определения глюкозы основан на действии глюкозооксидазы и предназначен для специфического определения глюкозы в биологических жидкостях в присутствии различных сахаров и других редуцирующих веществ неуглеводной природы. Глюкозооксидаза (КФ 1.1.3.4) относится к флавопротеинам (кофермент – ФАД). Глюкоза окисляется при действии фермента с образованием Н₂О₂ и глюконата. Возникшую перекись водорода определяют реакцией, катализируемой ферментом пероксидазой, с последующим окислительным азосочетанием производного фенола с 4-аминофеназоном (хромогенный кислородный акцептор). В ходе реакции образуются окрашенные в розовый цвет продукты. Количественное определение глюкозы заключается в измерении интенсивности окраски красителя и сравнении оптической плотности испытуемой пробы с окраской калибровочного раствора глюкозы.

Порядок выполнения работы:

1). В пробирку №1 (опыт) вносят 0,01 мл сыворотки крови и 1 мл рабочего раствора

(ферментно — хромогенная смесь)

2). В пробирку №2 (контроль) вносят 0,01 мл стандартного раствора глюкозы

(концентрация глюкозы 10 ммоль/л) и 1 мл рабочего раствора

3) Пробирки перемешивают и инкубируют в термостате 30 минут при 37 о С

4) Измеряют оптическую плотность опытной пробы (А_опыта) и контроля (А_{контроля})

на ФЭКе против Н₂О _дистил при длине волны 540 нм

5) Рассчитывают содержание глюкозы по формуле:

Глюкоза (ммоль/л) = (10×А_опыта) : А_{контроля}

В выводах сопоставить величины нормального содержанию глюкозы в крови с данными, полученными в результате проделанной работы.

Клинико-диагностическое значение. Благодаря существованию сложных регуляторных механизмов, концентрация глюкозы в крови сохраняется относительно постоянной – 3.3-5.5 ммоль/л. Концентрация глюкозы в крови зависит от строгой регуляции интенсивности процессов распада и синтеза гликогена, глюконеогенеза, скорости всасывания глюкозы в ЖКТ и окисления ее в тканях с высвобождением энергии.

Гипогликемия – понижение содержания глюкозы в крови. Гипогликемия наблюдается при длительном голодании; сопровождает заболевания поджелудочной железы, опухолевый рост, тяжелые поражения печени, эндокринные нарушения; наблюдается при передозировке инсулина. При гипогликемии ниже 2.7 ммоль/л возникает риск развития гипогликемической комы.

Гипергликемия– повышенное содержание глюкозы в крови (более 6 ммоль/л). Физиологическая гипергликемия наблюдается после приема пищи, при эмоциональном стрессе. Гипергликемия сопровождает эндокринные нарушения (сахарный диабет, гипертиреоз), острый и хронический панкреатиты, заболевания печени, сердечно-сосудистые заболевания и др. При гипергликемии выше 22 ммоль/л развивается гипергликемическая кома.

Глюкозотолерантныйтест

( метод«сахарной нагрузки» или построение «сахарных кривых»)

Принцип метода: Глюкозотолерантный тест – оценка углеводного обмена, основанная на определении уровня глюкозы в крови натощак и после нагрузки. Тест позволяет выявлять скрытые формы сахарного диабета и нарушение толерантности к глюкозе.

Порядок выполнения работы:

1. Первоначально определяют концентрацию глюкозы в крови натощак

Проведение глюкозотолерантного теста возможно только при условии, что результат исследования глюкозы натощак не превышает 6,7 ммоль/л. Подобное ограничение связано с повышением риска возникновения гипергликемической комы при нагрузке.

2. Пациент употребляет около 75 г глюкозы, которая растворена в 200 мл воды (из расчета 1 г/кг массы тела).

3. Через 30, 60, 90 и 120 минут после нагрузки проводят забор крови и определяют концентрацию глюкозы.

4. Результаты определения используются дл построениягликемическихкривых:

У здорового человека после приема глюкозы наблюдается увеличение ее содержания в крови, которое между 30-й и 60-й минутой достигает максимальной величины. Затем начинается снижение и к 120-й минуте содержание глюкозы достигает исходного уровня, отмечавшегося натощак или с небольшими отклонениями в сторону, как повышения, так и снижения. Через 3 ч содержание сахара в крови достигает исходной цифры. У больных сахарным диабетом отмечается повышенный исходный уровень глюкозы и высокая гипергликемия (свыше 8 ммоль/л) уже через час после сахарной нагрузки. Уровень глюкозы остается высоким (свыше 6 ммоль/л) в течение всего второго часа и к концу исследования (через 3 ч) не возвращается к исходному уровню. Одновременно отмечается глюкозурия.

Интерпретация результатов глюкозотолерантного теста:

Общие условия выбора системы дренажа: Система дренажа выбирается в зависимости от характера защищаемого.

Организация стока поверхностных вод: Наибольшее количество влаги на земном шаре испаряется с поверхности морей и океанов (88‰).

источник

Глюкоза является основным углеводом крови человека; ее содержание в цельной крови натощак составляет З,3—5,5 ммоль/л; в сыворотке венозной крови натощак 3,4-6,1 ммоль/л. Другие углеводы фруктоза, манноза, галактоза, лактоза и пентозы — обнаруживаются в значительно меньших или следовых количествах. Под «сахаром крови» в узком смысле слова подразумевают только глюкозу. На уровень глюкозы крови оказывает влияние поступление углеводов с пищей; мобилизация гликогена печени; глюконеогенез; окисление глюкозы в тканях; синтез гетерополисахаридов, пентоз, аминокислот, синтез гликогена и жира и тканях. Глюкоза, являясь одним из важнейших компонентов крови, почти поровну распределяется между плазмой и форменными элементами с некоторым превышением ее концентрации в плазе. Поскольку глюкоза относится к альдогексозам, а альдегидная группа легко окисляется, то это широко используется при определении глюкозы. Для определения глюкозы крови предложено много методов, которые условно можно разделить на 3 группы:

1.Редуктометрические методы основаны на восстанавливающих свойствах глюкозы (метод Хагедорна-Иенсена; Фолина; Фолина-Ву и др.). Недостаток указанных методов заключается в том, что в сущности они определяют не только глюкозу, но и ряд других редуцирующих веществ (глутатион, АДФ, мочевая кислота, креатин, глюкуроновые кислоты, витамин С), присутствие которых может при вести к определению не «чистой глюкозы», а «кажущегося сахара» [Медицинские…, 1999]. Эта группа методов обладает низкой специфичностью и значительной трудоемкостью.

Колориметрические методы основаны на цветных реакциях глюкозы с некоторыми соединениями, например серной кислотой, пикринововой кислотой, антроном, ортотолуидином. Этими методами определяются все альдогексозы, но поскольку основным представителем альдогексоз является глюкоза, то получаемые результаты близки к содержанию истинной глюкозы в крови. Недостаток методов — высокая токсичность используемых реактивов.

3. Энзиматические методы являются наиболее специфичными и точными методами количественного определения глюкозы, в частности, глюкозооксидазный метод, с помощью которого определяют содержание «истинной глюкозы», равное З,4—5,6 ммоль/л [Trinder P., 1969; Долгов В.В. и др., 19…, Медицинские…, 1999]. Определение проводят натощак, чтобы избежать пищевой гипергликемии.

В ряде случаев требуется экспресс определение глюкозы крови. Для этих целей используют биохимические анализаторы — глюкометры, позволяющие провести определение глюкозы в течении 2-3 минут после забора крови. В основе работы анализаторов, как правило, лежит глюкозоксидазный метод.

Принцип метода: Глюкозоксидаза специфически катализирует перенос двух водородных атомов с первого углеродного атома глюкозы на кислород воздуха. При этом в ходе реакции образуется в эквимолярных количествах перекись водорода, которая разлагается вторым ферментом – пероксидазой, а выделяющийся в процессе реакции атомарный кислород окисляет добавленный в реакционную смесь производного фенола с 4-аминофеназином, который изменяет окраску. Интенсивность окраски пропорциональна содержанию глюкозы [Trinder P., 1969].

Ход определения: в три пробирки отмеривают по 1` мл глюкозового реактива. В первую пробирку прибавляют 0,1 мл стандартного раствора глюкозы (стандартная проба), во вторую 0,1 мл сыворотки крови (исследуемая проба) и в третью — 0,1 мл дистиллированной воды (контроль). Все пробы перемешивают и инкубируют в течении 15 минут при температуре 37 С. Затем измеряют оптическую плотность пробы и стандарта против контрольного раствора. Светофильтр синий 425-500 нм в кюветах с рабочим расстоянием 10 мм.

Схема определения глюкозы в сыворотке крови

источник

Принцип. Глюкоза окисляется в присутствии глюкозооксидазы согласно реакции: Глюкоза + О₂ → глюконолактон + Н₂О₂. Образующаяся перекись водорода под действием пероксидазы окисляет субстрат с образованием окрашенного продукта: о-Дианизидин + Н₂О₂ → о-Дианизидин (ОКИСЛЕННЫЙ) + Н₂О. Интенсивность окрашивания пропорциональна концентрации глюкозы.

Реактивы (по наборам НТПК «Анализ-Х», Белоруссия).

1. Буферный раствор, рН=6,0, 2х200 мл.

2. Реагент (смесь ферментов), 2х0,2 г.

3. Депротеинизирующий реактив (концентрат 30% ТХУ), 10 мл.

4. Стандарт глюкозы 5,55 моль/л, 2,0 мл.

5. Стандарт глюкозы 16,0 ммоль/л, 2,0 мл.

Набор рассчитан на 400 определений при расходе 1 мл рабочего реагента, или 200 определений при расходе 2 мл. Линейная область: 2-27 ммоль/л.

Приготовление рабочего реагента. За час до проведения анализа содержимое флакона 2 растворяют буферным раствором из флакона 1. Рабочий реагент хранится в темном месте при температуре 2-8 о С в течение недели.

Определение концентрации глюкозы в плазме, сыворотке крови и моче. Мочу перед анализом разводят дист. водой в отношении 1:5 или 1:10, в зависимости от оказания качественной реакции, и результат умножают на коэффициент разведения. Компоненты в реакционной смеси отбирают в количествах согласно данным таблицы:

Время	Концентрация глюкозы в крови
Толерантность в норме	Толерантность снижена	Сахарный диабет
Натощак	Норма

Отмерить (мл)	Опытная проба	Стандарт	Холостая проба
Сыворотка, плазма, моча	0,01
Стандарт глюкозы	0,01
Дистиллированная вода	0,01
Рабочий реагент	1,00	1,00	1,00

Реакционную смесь перемешивают и инкубируют 15 мин при 37 о С.

Измеряют оптическую плотность опытной пробы А_оп и стандартной пробы А_ст против холостой пробы при длине волны 510 нм (сине-зеленый светофильтр), в кювете с рабочей шириной 10 мм.

Расчет концентрации глюкозы производят по формуле:

А_оп где С_оп – концентрация в опытной пробе (моль/л),С_оп=· С_ст А_оп – оптическая плотность опыта,
А_ст А_ст — оптическая плотность стандарта,
С_ст — концентрация стандарта (5,55 ммоль/л).

Определение глюкозы в цельной крови. Цельную кровь депротеинизируют 3% раствором ТХУ. Глюкозу определяют в надосадочной жидкости после центрифугирования. Объемы компонентов приведены в таблице:

Отмерить (мл)	Опытная проба	Стандарт	Холостая проба
Цельная кровь	0,05
Стандарт	0,05
Дистиллированная вода	0,05
3% раствор ТХУ	0,5	0,5	0,5

Пробу перемешивают и центрифугируют 10 мин при 1500 об./мин.

Надосадочная жидкость	0,10	0,10	0,10
Рабочий реагент	1,00	1,00	1,00

Далее измерение проводят так же, как при анализе без депротеинирования. Расчет концентрации глюкозы производят по указанной выше формуле. В случаях, когда оптическая плотность опытной пробы превышает 0,85, образец разводят дистиллированной водой в соотношении 1:1, а полученный результат умножают на 2.

Нормальные величины:
Сыворотка (плазма): 4,2-6,1 ммоль/л.

В ходе выполнения аналитических исследований осуществляется контроль качества.

источник

Сегодня наибольшее распространение получили методы, основанные на использовании фермента – глюкозооксидазы. В основе метода лежит следующая реакция:

Глюкозооксидаза катализирует перенос двух водородных атомов с первого углеродного атома глюкозы на кислород, растворенный в жидком реагенте. При этом в ходе реакции образуется в эквимолярных количествах перекись водорода. Т.е. концентрация образовавшейся перекиси водорода точно равна определяемой концентрации глюкозы. Следовательно, использование глюкозооксидазной реакции, трансформировало задачу определения концентрации глюкозы в задачу определения концентрации перекиси водорода, которая, как будет показано ниже, значительно проще первой. И здесь есть несколько способов, широко используемых сегодня в лабораторной практике (см. схему).

Среди вышеперечисленных способов регистрации наибольшее распространение получил фотометрический биохимический метод, в котором молекулы перекиси водорода под действием фермента пероксидазы расщепляются с образованием активной формы кислорода – супероксид анион-радикала – О₂ — , который в свою очередь окисляет хромоген, что приводит к значительному изменению спектра поглощения хромогена.

Большая популярность данного метода определения глюкозы объясняется его высокой специфичностью и простотой выполнения. Метод можно реализовать как с применением обычного фотометра, так и с помощью автоматических биохимических автоанализаторов.

Глюкозооксидазный метод признан сегодня одним из самых точных количественных методов определения глюкозы. В качестве биологического материала используется как сыворотка крови, так и цельная кровь. При работе с последней следует учитывать тот факт, что при взятии капиллярной крови доля сыворотки (плазмы) зависит от величины гематокрита, что может негативно отразиться на точности результата. Поэтому при определении глюкозы вышеописанным методом предпочтительно использовать сыворотку крови пациента.

Наряду с методом фотометрирования по конечной точке, несколько лет назад появились наборы, в которых реализован кинетический метод фотометрирования. Суть метода состоит в том, что при определенном соотношении активностей глюкозооксидазы и пероксидазы, скорость образования окрашенного соединения некоторое время после внесения пробы в рабочий раствор будет пропорциональна концентрации глюкозы в пробе. Преимущество такого метода состоит в том, что результат не зависит от наличия в пробе других соединений, поскольку поглощение последних стабильно во времени. Этот метод требует применения кинетического фотометра, полуавтоматических анализаторов или автоматических биохимических анализаторов. Измерение концентрации глюкозы из цельной крови удобно выполнять с помощью приборов, работа которых основана на амперометрическом принципе измерения, при помощи специальных ферментных датчиков. Перекись водорода является крайне нестабильным химическим соединением, и она может служить источником заряженных частиц. Именно это и используется в ферментных датчиках мембранного типа или электрохимических элементах портативных глюкометров.

В заключении следует упомянуть и о недостатках глюкозооксидазного метода. Образующаяся перекись водорода и супероксид анион-радикал могут окислять не только хромоген, но и другие вещества, присутствующие в биологической жидкости: аскорбиновую кислоту, мочевую кислоту, билирубин. При этом, соответственно, доля перекиси, принимающая участие в окислении хромогена, снижается, что приводит к занижению результата по глюкозе. Этот метод линеен, как правило, до 20-30 ммоль/л глюкозы.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Лучшие изречения: Сдача сессии и защита диплома — страшная бессонница, которая потом кажется страшным сном. 8551 — | 7051 — или читать все.

источник

Ориентировочная основа деятельности студентов для проведения лабораторной работы: Определение содержания глюкозы в крови глюкозооксидазным методом

Порядок выполнения работы:

1). В пробирку №1 (опыт) вносят 0,01 мл сыворотки крови и 1 мл рабочего раствора

(ферментно — хромогенная смесь)

2). В пробирку №2 (контроль) вносят 0,01 мл стандартного раствора глюкозы

(концентрация глюкозы 10 ммоль/л) и 1 мл рабочего раствора

3) Пробирки перемешивают и инкубируют в термостате 30 минут при 37 о С

4) Измеряют оптическую плотность опытной пробы (А_опыта) и контроля (А_{контроля})

на ФЭКе против Н₂О _дистил при длине волны 540 нм

5) Рассчитывают содержание глюкозы по формуле:

Гипергликемия – повышенное содержание глюкозы в крови (более 6 ммоль/л). Физиологическая гипергликемия наблюдается после приема пищи, при эмоциональном стрессе. Гипергликемия сопровождает эндокринные нарушения (сахарный диабет, гипертиреоз), острый и хронический панкреатиты, заболевания печени, сердечно-сосудистые заболевания и др. При гипергликемии выше 22 ммоль/л развивается гипергликемическая кома.

Порядок выполнения работы:

1. Первоначально определяют концентрацию глюкозы в крови натощак

2. Пациент употребляет около 75 г глюкозы, которая растворена в 200 мл воды (из расчета 1 г/кг массы тела).

3. Через 30, 60, 90 и 120 минут после нагрузки проводят забор крови и определяют концентрацию глюкозы.

4. Результаты определения используются дл построения гликемических кривых:

Интерпретация результатов глюкозотолерантного теста:

Концентрация глюкозы в крови

источник

Метод специфичен и точен, дает возможность определять только “истинную” глюкозу, поэтому предложен в качестве универсального для всех клиник нашей страны. Согласно этому способу, содержание глюкозы в крови натощак составляет 3,3-5,5 ммоль/л.

Принцип метода. В его основе лежат следующие реакции:

Глюкоза + Н₂О + О₂ Глюконат + Н₂О₂;

2Н₂О₂ + фенол + 4-аминоантипирин 4-(n-бензохиноно-

Глюкоза в присутствии фермента глюкозооксидазы окисляется кислородом воздуха с образованием пероксида водорода, при разрушении которого под влиянием пероксидазы происходит конденсация фенола и 4-аминоантипирина в окрашенное соединение 4-(n-бензохинономоноимино)-феназон. Количество последнего прямо пропорционально содержанию глюкозы в пробе.

Реактивы. Рабочий реактив, готовый к использованию, содержит фосфатный буфер (250 ммоль/л, рН 7), фенол (5 ммоль/л), 4-аминоантипирин (500 мкмоль/л), глюкозооксидазу (более 250 мккат/л), пероксидазу (более 50 мккат/л). Образцы, которые не исследуются сразу же по получению, необходимо хранить в пробирках, содержащих фторид, либо йодацетат натрия. Последние тормозят гликолиз и стабилизируют уровень глюкозы.

В 3 инкубационные кюветы с длиной оптического пути 1 см внесите по 1 мл рабочего реагента, подогрейте до 37°С в течение 5 мин, добавьте во вторую и третью соответственно по 10 мкл стандартного раствора глюкозы и образца (serum или плазму), тщательно перемешайте, инкубируйте 5 мин и измерьте при λ=500 нм абсорбцию стандарта и образца относительно бланка (холостой пробы в первой кювете). Вычислите концентрацию глюкозы по следующей формуле: С_оп = С _ст · Е _оп / Е_ст = ммоль/л, где — С_ст — концентрация стандартного раствора глюкозы; Е_оп — оптическая плотность опытного раствора; Е_ст — оптическая плотность стандартного раствора глюкозы. Линейность метода — до 22 ммоль/л, при необходимости образец разведите в физрастворе и результат умножьте на коэффициент разбавления.

Контроль выполнения лабораторной работы

К какому классу ферментов относится глюкозооксидаза?

Каково в норме содержание глюкозы в моче?

Предположительно при патологии каких эндокринных образований меняется концентрация глюкозы в крови?

Каков почечный порог для глюкозы?

Принцип глюкозооксидазного метода определения уровня глюкозы в биологических жидкостях.

Роль углеводов в питании человека.

Судьба гликогена в печени и мышцах.

Особенности переваривания и всасывания углеводов у грудных детей.

Тема: Гликолиз. Синтез глюкозы из неуглеводных компонентов. Обмен других моносахаридов.

Цель: Изучить течение реакций распада глюкозы, их значение в организме. Сформировать представление о механизмах поддержания гомеостаза глюкозы. Рассмотреть метаболизм отдельных моносахаридов (галактоза, фруктоза, манноза), их включение в реакции гликолиза и специфические пути обмена.

Значение: От интенсивности процессов гликолиза и глюконеогенеза зависит содержание АТФ в клетке, кроме того, из углеводов в процессе распада образуется большое число органических соединений, которые служат исходными субстратами для синтеза липидов, аминокислот, нуклеотидов.

Классификация углеводов. Биологическая роль моно-, ди- и полисахаридов.

Строение гексоз, ПВК, молочной кислоты, гликогена.

Химические свойства моносахаридов, понятие о полуацетальном гидроксиле, гликозидных связях.

Обмен гликогена, роль в организме. Суточные колебания содержания глюкозы в крови.

Аминокислоты, классификация и строение.

Классификация липидов, глицерол как один из компонентов липидов.

Классификация ферментов. Функции ферментов различных классов.

Строение АТФ. Пути синтеза.

Электронно-транспортная цепь, роль отдельных звеньев.

Общие пути катаболизма (окислительное декарбоксилирование ПВК, ЦТК).

Вопросы для самоподготовки

Судьба глюкозы в клетке. Основные пути её использования.

2. Особенности течения реакций гликолиза, локализация процесса в клетке, химизм процесса, энергетическая ценность, биологическая роль. Гликолитическая оксидоредукция.

3. Судьба молочной кислоты. Цикл Кори (глюкозо-лактатный цикл).

4. Значение реакций гликолиза и гликогенолиза в норме и при различных патологических состояниях.

5. Аэробный распад глюкозы. Переключение гликолиза на аэробный путь окисления. Малат-аспартатный челночный механизм. Энергетическая ценность распада глюкозы в аэробных условиях.

6. Процессы брожения, роль в организме. Сходство и различия гликолиза и брожения.

7. Реакции глюконеогенеза, субстраты процесса, его химизм, роль в поддержании уровня глюкозы в крови. Роль фермента глюкозо-6-фосфатазы.

8. Особенности обмена галактозы и фруктозы, биологическая роль данных моносахаридов для организма в различные возрастные периоды. Молекулярная патология моносахаридов.

источник